陳太強(qiáng) 蔣丁勝 魏翔 陳軍

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心臟大血管外科

主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)是一類(lèi)病情兇險(xiǎn)、死亡率高的心血管急危重癥，如未及時(shí)診治，在患者發(fā)病48 h內(nèi)，病死率會(huì)以每小時(shí)增加1%的速度增長(zhǎng)，1周時(shí)達(dá)70%，3個(gè)月時(shí)可高達(dá)90%[1]。由于血管內(nèi)異常血流或高血壓損傷血管內(nèi)膜，血流經(jīng)破口進(jìn)入中膜層，AD患者的血管壁中層會(huì)沿血管長(zhǎng)軸方向撕裂剝脫形成真假兩腔。調(diào)查結(jié)果顯示，AD發(fā)病率約為3人/10萬(wàn)人/年[2]。目前除血管置換和覆膜支架置入等治療方法外，尚無(wú)有效的保守治療方案，并且AD發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。有研究提示主動(dòng)脈中層退變(包括平滑肌細(xì)胞減少、彈性纖維斷裂、蛋白聚糖聚集等)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等是導(dǎo)致AD發(fā)生的重要病理因素[3]，但調(diào)控這些病理過(guò)程的分子機(jī)制知之甚少。因此，進(jìn)一步闡明AD發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)于尋找新的治療靶點(diǎn)有重要的臨床價(jià)值。

FERMT1基因位于染色體20p12.3位點(diǎn)，編碼fermitin家族同源蛋白1(又稱(chēng)kindlin1)，是FERMT家族成員之一[4]。研究表明，F(xiàn)ERMT1是一個(gè)磷酸蛋白且參與表皮角質(zhì)細(xì)胞的極化、增殖和死亡[4]。同時(shí)，F(xiàn)ERMT1缺失使角質(zhì)細(xì)胞對(duì)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和DNA損傷更敏感[5]。此外，F(xiàn)ERMT1通過(guò)激活ERK信號(hào)通路抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[6]。在AD的病理過(guò)程中，平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及氧化應(yīng)激損傷都在其中發(fā)揮重要作用。盡管FERMT1對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的增殖、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控作用已經(jīng)明確，但其是否參與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的功能以及其是否影響AD的發(fā)生發(fā)展尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在明確FERMT1在AD發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)模式及其對(duì)AD可能的影響，為闡明AD的發(fā)病機(jī)制以及篩選潛在的治療靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

隨機(jī)選取在我院確診為Stanford A型AD(Stanford type A aortic dissection，TAAD)并接受手術(shù)治療的患者13例作為夾層組，因終末期心力衰竭行心臟移植的患者11例作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并動(dòng)脈炎、馬凡綜合征、腫瘤、創(chuàng)傷性或醫(yī)源性AD以及艾滋病等傳染性疾病的患者。本研究中所有涉及人體組織樣本的采取程序均符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)《赫爾辛基宣言》的原則，獲得患者本人或家屬的知情同意，且經(jīng)過(guò)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 基本資料 收集各組患者基本信息，包括年齡、性別、飲酒史、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、入院心率、收縮壓和舒張壓。采集患者的CT血管成像和三維重建影像，并測(cè)量主動(dòng)脈弓部、升主動(dòng)脈部、降主動(dòng)脈部和腹主動(dòng)脈部的主動(dòng)脈內(nèi)徑。

1.2.2 組織樣品收集 13例夾層組樣本與11例對(duì)照組組織獲取后迅速分裝，分別于4%中性甲醛固定和-80℃凍存用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 組織化學(xué)檢測(cè) 固定組織經(jīng)脫水、石蠟包埋處理。包埋后的主動(dòng)脈壁組織制備成5 μm厚的切片，依次按脫蠟、水化、染色等標(biāo)準(zhǔn)處理，分別完成蘇木精-伊紅(HE)染色和彈性纖維(EVG)染色，封片后鏡下觀察拍照。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) 取液氮凍存血管組織標(biāo)本約100 mg，低溫液氮中研磨，加入Trizol(15596-26，Invitrogen)裂解，10 min后加入氯仿抽提，12 000 rpm離心15 min，水相上清加入異丙醇進(jìn)行RNA沉淀，加入DEPC配制的75%乙醇進(jìn)行RNA沉淀漂洗。待白色沉淀干燥，加入DEPC水溶解。測(cè)定RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。?zhǔn)備PCR反應(yīng)體系(SYBR Green、FERMT1正向引物GCTTCTGAAAACCCACTGGA、FERMT1反向引物ATCTTCAAATTCGGCAGACG、ddH2O)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀內(nèi)測(cè)定并記錄。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 取凍存血管組織標(biāo)本約100 mg，低溫液氮中研磨組織，加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒(ThermoFisher scientific，23225)測(cè)定蛋白濃度。蛋白定量，電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃下用含一抗(FERMT1，Cat No. 22215-1-AP，Proteintech)的抗體稀釋液孵育過(guò)夜。次日TBST緩沖液洗膜3次，加入相對(duì)應(yīng)的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，111-035-003)，室溫孵育1 h，ChemiDocTM XRS+成像系統(tǒng)(Bio-Rad)下顯影，檢測(cè)FERMT1蛋白表達(dá)信號(hào)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 固定組織常規(guī)脫水，透明、石蠟包埋，制備5 μm切片。烘箱中烤片60 min，二甲苯中脫蠟處理3次，梯度濃度酒精水合，于檸檬酸鹽緩沖液中微波修復(fù)10 min，3%過(guò)氧化氫37℃孵育20 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS浸洗切片3次，8%羊血清封閉60 min，F(xiàn)ERMT1一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS浸洗3次，HRP標(biāo)記二抗?jié)窈袃?nèi)孵育90 min。PBS浸洗，滴加DAB工作液顯微鏡下觀察顯色效果，洗去余色，蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗，脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察拍照，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組的基本臨床數(shù)據(jù)比較

較對(duì)照組，AD組患者的年齡較大，合并更多高血壓，收縮壓水平顯著升高(均為P<0.05)，其余基本資料兩組間無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

表1 TAAD患者與對(duì)照組臨床資料對(duì)比

2.2 各組的組織樣本結(jié)構(gòu)分析比較

HE染色和EVG染色顯示，對(duì)照組主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列緊密有序，彈性纖維完整連續(xù)；而夾層組主動(dòng)脈血管壁組織明顯破壞，平滑肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞核縮小，平滑肌細(xì)胞間少量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，彈性纖維不完整，斷裂嚴(yán)重，呈碎片化(圖1)。

2.3 各組的FERMT1 mRNA與蛋白表達(dá)分析

RT-PCR檢測(cè)組織中FERMT1的mRNA含量，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，F(xiàn)ERMT1的mRNA表達(dá)水平在夾層組主動(dòng)脈血管組織中顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

免疫印跡法檢測(cè)主動(dòng)脈壁中FERMT1的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)夾層組主動(dòng)脈壁中FERMT1的蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果同樣證明，F(xiàn)ERMT1蛋白含量在夾層組中顯著降低(P<0.05)，且FERMT1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖4)。

圖1 兩組主動(dòng)脈壁的HE和EVG染色

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FERMT1基因在對(duì)照組(n=11)和夾層組(n=13)主動(dòng)脈組織中mRNA表達(dá)水平

圖3 Western blot檢測(cè)FERMT1在對(duì)照組(n=7)和夾層組(n=7)主動(dòng)脈組織中的蛋白表達(dá)水平

圖4 免疫組織化學(xué)染色顯示FERMT1的表達(dá)及在主動(dòng)脈壁中細(xì)胞定位

2.4 主動(dòng)脈直徑與FERMT1 mRNA表達(dá)量相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，升主動(dòng)脈內(nèi)徑、主動(dòng)脈弓內(nèi)徑、胸主動(dòng)脈內(nèi)徑、腹主動(dòng)脈內(nèi)徑與FERMT1 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著相關(guān)(圖5)。

圖5 AD患者的主動(dòng)脈直徑與FERMT1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

FERMT1基因在2003年被首次報(bào)道與Kindler綜合征有關(guān)[4]，與FERMT2、FERMT3基因共同屬于FERMT家族，分別編碼kindlin1、kindlin2、kindlin3蛋白。Kindlin1主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，kindlin2在體內(nèi)廣泛表達(dá)，而kindlin3表達(dá)于造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[4，7-8]。Kindlin1和kindlin2參與細(xì)胞的局部粘附作用，其中kindlin2還參與細(xì)胞間連接作用[7，9]，kindlin3定位于細(xì)胞偽足[10]。有報(bào)道稱(chēng)，kindlin1缺失后，角化細(xì)胞的遷移、粘附和伸展能力均下降，細(xì)胞出現(xiàn)多尖端和多極形狀變化[11-13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，kindlin1參與整合素的功能調(diào)控，而整合素是一類(lèi)含α和β亞基位于細(xì)胞表面的糖蛋白，作為細(xì)胞的受體兼具細(xì)胞粘附和信號(hào)傳導(dǎo)的功能[14]。Kindlin1與整合素胞內(nèi)段β亞基相互作用，調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖、粘附和分化。研究顯示，F(xiàn)ilamin A(FLNA)在AD患者中表達(dá)量發(fā)生顯著變化，而FLNA可與整合素相互作用，調(diào)控細(xì)胞骨架從而影響細(xì)胞的形狀和遷移[15]。TGF-β信號(hào)通路對(duì)AD具有重要的調(diào)控作用，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)通路中多個(gè)分子的突變與AD的發(fā)生密切相關(guān)，如TGFBR1、TGFBR2、TGFB2、TGFB3、SMAD2、SMAD3、SMAD4等[16]，不僅如此，該通路對(duì)平滑肌細(xì)胞的功能、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌等均具有重要調(diào)控作用。FERMT1可通過(guò)調(diào)控Wnt和TGF-β信號(hào)通路影響皮膚干細(xì)胞的增殖[17]，但在AD發(fā)生過(guò)程中，F(xiàn)ERMT1是否也可以通過(guò)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路影響AD的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。除TGF-β信號(hào)通路外，F(xiàn)ERMT1還可調(diào)控β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[18]，通過(guò)調(diào)控ERK信號(hào)通路抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無(wú)夾層的正常主動(dòng)脈相比，AD患者主動(dòng)脈壁中FERMT1的mRNA和蛋白水平均顯著降低，提示FERMT1可能參與調(diào)控AD的病理過(guò)程，而且本團(tuán)隊(duì)已發(fā)表的研究成果也顯示，在AD患者主動(dòng)脈壁中，β-catenin以及MAPK-ERK信號(hào)通路均被明顯抑制[19]，提示FERMT1有可能通過(guò)調(diào)控β-catenin以及MAPK-ERK信號(hào)通路影響AD的病理過(guò)程以及進(jìn)展。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ERMT1的基因表達(dá)與主動(dòng)脈內(nèi)徑無(wú)顯著相關(guān)性，該分子可能成為AD的預(yù)測(cè)分子，與AD的發(fā)生相關(guān)，而與AD的進(jìn)展過(guò)程無(wú)關(guān)[20]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)FERMT1的mRNA和蛋白水平在AD患者中均顯著降低，提示其對(duì)AD可能具有重要的調(diào)控作用，其調(diào)控AD的分子機(jī)制可能與整合素、TGF-β、β-catenin以及MAPK-ERK信號(hào)通路相關(guān)。然而，F(xiàn)ERMT1對(duì)AD的具體作用以及分子機(jī)制均需進(jìn)一步研究，本文的研究結(jié)果提示FERMT1與AD的發(fā)生可能存在一定的聯(lián)系，為該基因?qū)D的功能研究奠定基礎(chǔ)，為臨床治療AD提供潛在的治療靶點(diǎn)和參考。

利益沖突：無(wú)