李先芳 林 璋

福建省老年醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建福州 350000

血管重構(gòu)是高血壓最主要的病理生理改變，也是高血壓損害靶器官的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1-2]。文獻(xiàn)表明原發(fā)性高血壓患者的頸動(dòng)脈發(fā)生明顯病理改變，主要表現(xiàn)為血管直徑和內(nèi)膜中層厚度明顯增加，這種病理改變即為頸動(dòng)脈血管重構(gòu)[3-5]。Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，ColⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenⅢ，ColⅢ)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，兩者的表達(dá)水平一定程度上可以反映血管壁重構(gòu)的程度[6]。研究表明，基因突變、內(nèi)皮功能損傷和炎癥反應(yīng)均可能導(dǎo)致血管重構(gòu)的發(fā)生[7]，但是其具體機(jī)制尚未清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是單鏈非編碼的高度保守型小分子RNA，對(duì)基因起著負(fù)調(diào)控的作用。文獻(xiàn)表明miRNA在心血管疾病包括高血壓的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與維持血管正常內(nèi)皮功能，對(duì)血管生成具有調(diào)控作用[9]。本研究旨在通過檢測(cè)miR-126在自發(fā)性高血壓大鼠中頸動(dòng)脈的表達(dá)，探討其在高血壓頸動(dòng)脈血管重構(gòu)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20周齡的雄性SHR大鼠和WKY大鼠各12只，體重（200±10）g，動(dòng)物購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（湘）2010-000。SHR大鼠為實(shí)驗(yàn)組，WKY大鼠為對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)儀器：XR900無創(chuàng)大鼠血壓心率測(cè)定儀（上海欣軟信息科技有限公司），Thermo Veriti7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Alpha-1860S紫外可見分光光度計(jì)。

實(shí)驗(yàn)試劑：Trizol 試劑（Invitrogen)，RT-PCR 試劑盒（Invitrogen）。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 血壓測(cè)量

兩組大鼠培養(yǎng)條件為：12h日夜交替、（24±2）℃和相對(duì)濕度60%，從20周齡培養(yǎng)至34周齡，期間每隔2周進(jìn)行血壓測(cè)量，使用無創(chuàng)大鼠血壓心率測(cè)定儀測(cè)量大鼠尾部動(dòng)脈收縮壓，每次重復(fù)測(cè)量3次，取3次的平均值為最終結(jié)果。

1.3 小鼠頸動(dòng)脈RNA提取及RT-PCR檢測(cè)

于34周，處死小鼠并取其頸動(dòng)脈組織。然后將頸動(dòng)脈組織至于液氮中保存。從液氮保存的組織中取5mg頸動(dòng)脈組織，Trizol試劑盒提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書和前期文獻(xiàn)描述步驟[10]，利用RT-PCR檢測(cè)頸動(dòng)脈 Col Ⅰ、Col Ⅲ和 miR-126的表達(dá)。以 β-actin為對(duì)照，采用 2－ΔΔCt方法分析 Col Ⅰ、Col Ⅲ和miR-126的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用Pearson方法分析miR-126與血管重構(gòu)的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組收縮壓比較

觀察組大鼠從20～34周期間收縮壓均高于140mm Hg，為高血壓，對(duì)照組大鼠20～34周期間收縮壓均低于140mm Hg，血壓正常。觀察組收縮壓顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.2 血管結(jié)構(gòu)觀察

與對(duì)照組比較，觀察組大鼠頸動(dòng)脈血管腔徑顯著小于對(duì)照組，觀察組中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑顯著大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表 3。

2.3 頸動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)

頸動(dòng)脈Col Ⅰ和Col Ⅲ的表達(dá)水平一定程度上可以反映頸動(dòng)脈重構(gòu)程度。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組和觀察組勁動(dòng)脈Col Ⅰ和Col Ⅲ的表達(dá)，結(jié)果顯示觀察組Col Ⅰ和Col Ⅲ均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

表2 兩組大鼠收縮壓比較

表2 兩組大鼠收縮壓比較

組別 20周 22周 24周 26周 28周 30周 32周 34周觀察組 166.51±5.04 164.65±4.12 167.33±6.26 168.37±4.45 165.98±5.47 167.39±4.24 168.53±5.19 170.84±4.36對(duì)照組 116.35±4.26 117.62±5.93 117.99±5.14 119.41±5.82 121.75±6.42 120.63±7.26 119.79±5.21 120.25±6.14 t 26.330 22.562 21.102 23.150 18.166 19.266 22.959 23.272 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 兩組頸動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（）

表3 兩組頸動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（）

組別 n 腔徑（μm） 中膜厚度（μm） 中膜橫截面積（mm2） 中膜厚度/腔徑（%）觀察組 12 593.84±67.51 87.65±7.62 0.226±0.044 13.16±2.53對(duì)照組 12 800.67±78.26 49.38±6.74 0.187±0.032 6.78±1.49 t 6.932 13.032 2.483 7.527 P＜0.001 ＜0.001 0.021 ＜0.001

表4 miR-126與頸動(dòng)脈重構(gòu)的相關(guān)性分析

圖1 Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白在對(duì)照組和觀察組的相對(duì)表達(dá)

2.4 miR-126在頸動(dòng)脈組織的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示觀察組miR-126表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 miR-126在對(duì)照組和觀察組頸動(dòng)脈的相對(duì)表達(dá)量

2.5 miR-126表達(dá)與頸動(dòng)脈血管重構(gòu)相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-126與中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑、ColⅠ型膠原蛋白和ColⅢ型膠原蛋白表達(dá)均為負(fù)相關(guān)（P＜0.05），miR-126與腔徑均無顯著相關(guān)性，見表4。

3 討論

高血壓是常見心血管疾病，也是導(dǎo)致心血管不良事件的主要原因之一。目前對(duì)原發(fā)性高血壓的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，隨著研究的深入，近年來，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)血管重構(gòu)既是高血壓患者重要的病理改變表現(xiàn)，同時(shí)又是維持高血壓狀態(tài)、導(dǎo)致靶器官受損的原因[11]。頸動(dòng)脈是脊椎動(dòng)物最主要的大動(dòng)脈之一，該動(dòng)脈的管壁含有大量的膠原蛋白和彈性蛋白，具有良好的彈性，以緩沖血壓的沖擊[12-13]。高血壓患者的血管變化主要為血管壁變硬，彈性下降，順應(yīng)性下降，血管管腔變窄，對(duì)血壓的緩沖能力減弱。miRNA是一段保守的單鏈非編碼RNA，可以調(diào)控人體約30%的基因表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖和凋亡，被稱為是基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與高血壓的發(fā)病過程，但其與血管重構(gòu)是否存在相關(guān)性還有待研究[15-16]。

本研究以SHR大鼠為觀察組，WKY大鼠為對(duì)照組，研究?jī)山M的血壓和頸動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)差異。發(fā)現(xiàn)從20～34周，觀察組大鼠收縮壓均符合高血壓特征，且顯著高于對(duì)照組。34周齡時(shí)，觀察組大鼠頸動(dòng)脈血管腔徑明顯縮小，中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑明顯增加。而血管壁變厚、中層細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)充是血管重構(gòu)的最顯著征象[17-18]，在本研究中，觀察組頸動(dòng)脈血管的形態(tài)發(fā)生顯著變化，為頸動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)提供一定的證據(jù)。細(xì)胞外基質(zhì)的改變是血管重構(gòu)的另一重要特征，在血管壁增厚變硬的過程中，膠原纖維的含量直接決定血管的彈性。Col Ⅰ和Col Ⅲ型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，兩者的表達(dá)變化是血管壁重構(gòu)的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組Col Ⅰ型和Col Ⅲ型表達(dá)顯著增加，且Col Ⅲ型增加較為顯著，說明SHR大鼠頸動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)，與薛揚(yáng)等[2]研究報(bào)道一致。

miRNA可以通過調(diào)控細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和內(nèi)皮功能等多種途徑參與血管重構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的作用，而內(nèi)皮細(xì)胞是維持血管功能動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵因素[19]。miR-126是一種特異高表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的miRNA，其表達(dá)水平與內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管重構(gòu)密不可分[20]。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組miR-126表達(dá)顯著低于對(duì)照組，說明miRNA低表達(dá)可能與血管重構(gòu)相關(guān)。目前相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)miR-126可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)來維持內(nèi)皮功能[21]，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-126的敲除會(huì)直接影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子依賴的下游通路受損，引起血管生產(chǎn)缺陷[22]。miR-126還能通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1通路調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)完整性[23]。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)miR-126的表達(dá)水平與中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑、Col Ⅰ和Col Ⅲ均為負(fù)相關(guān)，說明miR-126低表達(dá)可能是導(dǎo)致血管重構(gòu)的原因之一。

綜上所述，自發(fā)性高血壓大鼠頸動(dòng)脈組織miR-126表達(dá)顯著降低，與中膜厚度、中膜厚度/腔徑、Col Ⅰ和 Col Ⅲ均為負(fù)相關(guān)，miR-126 有望成為高血壓治療的新靶點(diǎn)。