李 靜，耿志軍，張小鳳，王敏達(dá)，郭 普

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；3.科研中心組織移植安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233004)

衣原體(Chlamydia)是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物。衣原體感染所致肺炎可形成持續(xù)性感染狀態(tài)，是導(dǎo)致肺炎復(fù)發(fā)、過敏性哮喘及心血管系統(tǒng)疾病的危險(xiǎn)因素[1-2]。免疫細(xì)胞間的交互作用在宿主抵御衣原體感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。該方向的研究有望為深入探索抗感染免疫調(diào)控機(jī)制提供新的視角。NK細(xì)胞及其分泌的IFN-γ在調(diào)控宿主免疫細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其交互作用在機(jī)體抵御衣原體感染中具有重要保護(hù)作用，通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的交互作用有望增強(qiáng)機(jī)體抗衣原體感染免疫能力[4-5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)IFNG-AS1，與小鼠(Ifng)和人(IFNG)中的IFN-γ編碼基因相鄰[6]。研究發(fā)現(xiàn)，IFNG-AS1可調(diào)控NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力[7]。目前，在衣原體感染中，IFNG-AS1調(diào)節(jié)NK細(xì)胞分泌IFN-γ對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用尚不清楚，更重要的是IFNG-AS1對(duì)衣原體呼吸道感染的作用也未見報(bào)道。本研究通過體內(nèi)上調(diào)IFNG-AS1表達(dá)，觀察衣原體呼吸道感染鼠的肺炎癥狀及巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，探討LncRNA IFNG-AS1調(diào)控NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞互作在衣原體感染中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物Hep-2細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基中。SPF級(jí)BALB/c小鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，6～8周齡，體重20～24 g，共計(jì)45只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(皖)2017-001。

1.2 鼠衣原體鼠衣原體(Chlamydia muridarum，C.muridarum)購自美國ATCC細(xì)胞庫(ATCC? VR-123TM)，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)擴(kuò)增。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑IFNG-AS1引物由上海生工生物工程有限公司合成；TRIzol購于美國thermo scientific公司(Cat: 10296010)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat: RR037A)、SYBRGreen II 熒光定量PCR試劑盒(Cat: RR420A)購于日本TaKaRa公司；蘇木素伊紅染液(Cat: G1120)購于北京索萊寶公司；RPIM1640培養(yǎng)基(Cat:11879020)、胎牛血清(Cat:10099141C)均購自美國Gibco BRL公司；IFNG-AS1過表達(dá)慢病毒由吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)合成；膠原酶XI(Cat: C9407)購自德國Sigma-Aldrich公司；NK細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒(Cat:130-096-892)購自德國美天旎公司；流式抗體(anti-DX5-FITC、CD3e-APC、IFN-γ-PE、iNOS-PE-cy7、CD206-APC、F4/80-PE)及IFN-γ ELISA試劑盒(Cat: 88-7314-22)均購自美國eBioscience公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與衣原體呼吸道感染模型建立本實(shí)驗(yàn)選取BALB/c小鼠，雄性，體重為20～24 g，將每只實(shí)驗(yàn)小鼠稱量體重并按從高到低從排序，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化的分組，并分為感染組(Cm組)、實(shí)驗(yàn)組(IFNG-AS1過表達(dá)組)及對(duì)照組(sham組)，5只/組，進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用滴鼻吸入C.muridarum建立呼吸道感染模型(1×103IFU/40 μL)，IFNG-AS1過表達(dá)組小鼠在感染基礎(chǔ)上給予滴鼻吸入IFNG-AS1過表達(dá)慢病毒(4×106PFU/40 μL，于感染前一天干預(yù))，Cm組滴鼻吸入對(duì)照慢病毒，以未處理鼠為sham組[7]。于建模后第5天頸椎脫臼法處死小鼠，取檢并檢測(cè)。

1.5 肺單個(gè)核細(xì)胞與NK細(xì)胞分離分離各組小鼠右肺上下葉，置于含膠原酶XI的完全培養(yǎng)基中，于37 ℃消化1 h，用鑷子將肺組織撕碎，采用注射器反復(fù)吹打，濾網(wǎng)過濾收集肺單個(gè)核細(xì)胞，破碎紅細(xì)胞后經(jīng)PBS洗去殘留的酶和培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。肺NK細(xì)胞分選按照美天旎磁珠分選試劑盒進(jìn)行，并采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定NK細(xì)胞純度。

1.6 肺組織病理學(xué)評(píng)估小鼠右肺中葉經(jīng)10%中性甲醛固定，采用石蠟包埋切片，HE染色。肺組織炎癥評(píng)分主要觀察呼吸道，血管周圍及肺間質(zhì)炎癥累及范圍[8]。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)提取肺組織及肺NK細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，IFNG-AS1引物序列如下：上游引物序列 5’-TGCCTAGGTGCTCTCTGATG-3’，下游引物序列 5’-GGCACAACCCATGGAAGAC-3’，GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列如下：上游引物序列 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物序列 5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGT CA-3’。

1.8 肺組織衣原體負(fù)荷檢測(cè)(IFUs)于生物安全柜中無菌分離小鼠左肺，置于冰SPG蔗糖緩沖液中研磨充分破碎組織。離心(3000 rpm，30 min)，取上清，感染Hep-2細(xì)胞，培養(yǎng)20 h左右，細(xì)胞經(jīng)甲醇固定，采用衣原體LPS抗體孵育(1∶50，37 ℃，2 h)，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1∶500，37 ℃，1 h)，4氯-1萘酚顯色液，室溫避光反應(yīng) 2 min，于100倍和400倍顯微鏡下分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野[9]。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)(FACS)制備肺單個(gè)核細(xì)胞懸液，取1×106個(gè)細(xì)胞，采用F4/80-PE、iNOS-PE-cy7、CD206-APC熒光抗體染色(置于4 ℃，染色30 min)，分析巨噬細(xì)胞M1(F4/80+iNOS+)、M2(F4/80+CD206+)的比例；另取2×106個(gè)細(xì)胞鋪板刺激培養(yǎng)6 h，先進(jìn)行表面染色(CD3e-APC、DX5-FITC，4 ℃，30 min)，破膜后再進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色(IFN-γ-PE)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析巨噬細(xì)胞M1/M2及分泌IFN-γ的NK細(xì)胞(CD3-DX5+IFN-γ+)的比例。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)小鼠肺單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ水平按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參考波長(zhǎng)570 nm。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad Prism 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。兩組之間差異顯著性分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 C.muridarum呼吸道感染促進(jìn)NK細(xì)胞中IFNG-AS1的表達(dá)C.muridarum感染后第5天，小鼠肺組織和肺NK細(xì)胞中IFNG-AS1的mRNA表達(dá)水平顯著高于Sham組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 小鼠肺組織和肺NK細(xì)胞中IFNG-AS1的mRNA表達(dá)水平

2.2 過表達(dá)IFNG-AS1減輕C.muridarum呼吸道感染小鼠的疾病狀況自C.muridarum呼吸道感染后第3天開始IFNG-AS1過表達(dá)組小鼠體重下降較Cm組減輕(圖2A)；IFNG-AS1過表達(dá)組小鼠肺組織損傷較Cm組減輕(圖2B、圖2C)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 小鼠疾病狀況

2.3 過表達(dá)IFNG-AS1降低C.muridarum呼吸道感染小鼠肺組織中衣原體負(fù)荷與Cm組相比，IFNG-AS1過表達(dá)組小鼠肺組織中衣原體負(fù)荷顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 小鼠肺組織中衣原體負(fù)荷(IFUs)

2.4 C.muridarum呼吸道感染中過表達(dá)IFNG-AS1增強(qiáng)NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ能力IFNG-AS1過表達(dá)組小鼠肺組織中分泌IFN-γ的NK細(xì)胞(DX5+IFN-γ+)比例顯著高于Cm組(圖4A、圖4B)；另外，與Cm組相比，IFNG-AS1過表達(dá)組小鼠肺單個(gè)核細(xì)胞中IFN-γ的蛋白表達(dá)水平也顯著升高(圖4C)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

2.5 C.muridarum呼吸道感染中過表達(dá)IFNG-AS1促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化與Cm組相比，IFNG-AS1過表達(dá)組小鼠肺組織中M1型巨細(xì)胞比例(F4/80+iNOS+)顯著增高(圖5A、圖5B)，M2型巨噬細(xì)胞比例顯著下降(圖5C、圖5D)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖4 NK細(xì)胞分泌IFN-γ的水平

圖5 小鼠肺巨噬細(xì)胞M1/M2比例

3 討論

本研究表明，在BALB/c小鼠呼吸道衣原體感染所致肺炎中，通過調(diào)控IFNG-AS1水平可增強(qiáng)NK細(xì)胞免疫功能。過表達(dá)IFNG-AS1可減輕C.muridarum感染小鼠肺組織病理損傷，降低肺部細(xì)菌負(fù)荷，這可能與高水平的IFN-γ及其對(duì)巨噬細(xì)胞M1型極化的促進(jìn)作用有關(guān)。

NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用在腫瘤免疫及感染性疾病中具有重要意義。Zeng Y 等在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)活化的NK細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子和趨化因子，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的募集和活化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞“crosstalk”，尤其是對(duì)巨噬細(xì)胞極化趨勢(shì)在機(jī)體抵御細(xì)菌感染等疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Roetynck S等報(bào)道在瘧疾中，單核/巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞相互作用產(chǎn)生的IFN-γ對(duì)機(jī)體保護(hù)性免疫應(yīng)答非常重要[11-12]。單核細(xì)胞在炎癥部位可通過分泌IL-12、IL-15和IL-18 等細(xì)胞因子，進(jìn)而影響NK細(xì)胞的表型變化，募集CD56bright NK細(xì)胞，NK細(xì)胞反過來也可以通過促進(jìn)TNF-α等的分泌活化巨噬細(xì)胞[13]。值得關(guān)注的是，Carl G.Feng等分離結(jié)核分枝桿菌感染的RAG- /-和IFN-γ mAb處理的小鼠巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在不存在NK來源的IFN-γ情況下，結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠肺中巨噬細(xì)胞是M2型，而不是M1型的，因此不能控制細(xì)菌生長(zhǎng)。而且NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ對(duì)巨噬細(xì)胞的M1的極化作用不依賴T細(xì)胞應(yīng)答[14]。NK細(xì)胞可根據(jù)細(xì)胞因子微環(huán)境以及與其他免疫細(xì)胞相互作用控制其對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性或正向免疫調(diào)節(jié)作用，在不同病原體感染中發(fā)揮不同的作用。在衣原體感染疾病中，通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的交互作用有望增強(qiáng)機(jī)體抗衣原體感染免疫能力。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long Noncoding RNAs，lncRNAs)通過與組蛋白修飾復(fù)合物中的蛋白質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄水平。IFNG-AS1，也稱為TMEVPG1或NeST，最初被認(rèn)為是解釋泰勒病毒對(duì)鼠的反應(yīng)差異的候選藥物[15]。IFNG-AS1在哺乳動(dòng)物對(duì)感染的敏感性或?qū)Σ≡w的免疫應(yīng)答中具有重要作用。我們的研究也證實(shí)了，通過上調(diào)IFNG-AS1，小鼠肺組織中NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力增強(qiáng)，肺單個(gè)核細(xì)胞分泌的IFN-γ水平也顯著增高。在細(xì)菌感染性疾病中，高水平的IFN-γ可加重機(jī)體炎癥損傷，而在體內(nèi)可有效抑制衣原體增殖[16]。既往的研究也報(bào)道了，高表達(dá)IFNG-AS1可增強(qiáng)小鼠抵抗腸炎沙門氏菌的能力[6]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了IFNG-AS1對(duì)細(xì)菌感染的抵御功能，我們通過滴鼻吸入IFNG-AS1過表達(dá)慢病毒，發(fā)現(xiàn)C.muridarum感染小鼠的體重下降減輕，HE染色結(jié)果顯示肺部炎癥及肺組織病理損傷減輕，肺部衣原體負(fù)荷(IFUs)也顯著降低。綜上，本研究提示在衣原體呼吸道感染模型中，上調(diào)IFNG-AS1可增強(qiáng)機(jī)體抵御衣原體感染的能力，減輕組織損傷，具有保護(hù)機(jī)體的作用，本研究與既往報(bào)道一致的是，驗(yàn)證了IFNG-AS1抵抗細(xì)菌感染的能力，不同的是，我們首先在胞內(nèi)菌感染性疾病中探討IFNG-AS1的作用。

綜上所述，靶向IFNG-AS1可增強(qiáng)NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力。過表達(dá)IFNG-AS1可促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ，增強(qiáng)其巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用，有助于機(jī)體清除肺部衣原體感染和減輕病理損傷。本研究在胞內(nèi)菌感染的模型中驗(yàn)證了IFNG-AS1調(diào)控NK細(xì)胞分泌IFN-γ的作用，進(jìn)一步證明了NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相互作用在抵御病原體感染中的重要性。我們的發(fā)現(xiàn)為靶向IFNG-AS1水平在感染性疾病中的治療作用提供依據(jù)。