蘭宏偉，王志強，趙若晗

(牡丹江醫(yī)學院 1.附屬紅旗醫(yī)院腫瘤科；2.科研處，黑龍江 牡丹江 157011)

肺癌是對人類健康威脅最大的惡性腫瘤之一，從全球范圍來看，肺癌在男性所有惡性腫瘤中發(fā)病率、死亡率均居于首位，在女性所有惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌、結直腸癌，死亡率僅次于乳腺癌[1]，在我國，肺癌分別居于男女惡性腫瘤發(fā)病率的首位及次位，且是男性和女性最常見的死亡原因,居同期惡性腫瘤死亡原因第一位[2]，而早在2004年，肺腺癌就超過了肺鱗癌成為了最普遍的肺癌分型[3]，給人類健康帶來了極大威脅。肺腺癌的診斷主要依靠影像學檢查，這種單一的檢查方式導致肺癌的早期檢出率低下，而靶向治療的缺乏又導致失去手術治療的患者難以得到有效的治療，這促使去尋找更多可能能有效診斷肺腺癌的標志物以及靶向藥物開發(fā)的潛在基因。

ETV4是ETS超家族的一員，也叫做E1A增強子結合蛋白(E1A Enhancer Binding Protein，E1AF)或多瘤病毒增強子激活劑3(Polyomavirus Enhancer Activator 3 Homolog，PEA3)，是新近發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉錄因子，位于染色體7q21.31位置[4]，在正常成熟組織中，ETV4一般低表達或只在特定器官組織中表達，并常處于自我抑制狀態(tài)[5]。而在腫瘤組織中，ETV4常常過度表達，例如ETV4在結直腸癌、肝癌、前列腺癌等對人類危害較大的惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達，并能發(fā)揮促癌作用[6-8]。相比于其他腫瘤，ETV4在肺癌中的研究卻只見少量研究報道，Yan Wang等在實驗中證明了ETV4能促進非小細胞肺癌的形成、轉移和侵襲[9]，在肺腺癌中，Cheng T 等人在2019年發(fā)表的文章中顯示ETV4在肺腺癌中的表達是升高的，并能促進肺腺癌的增殖、轉移[10]。

近年來，高通量測序技術及基因芯片研究受到了醫(yī)藥領域的廣泛關注，而一些數(shù)據(jù)庫含有大量樣本的特征為醫(yī)學研究的可靠性及可行性提供了一定的保證。通過對這些數(shù)據(jù)庫的研究分析，可以分析基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用，以獲得具有早期診斷或靶向藥物研究潛力的關鍵基因。在此基礎上，本文希望通過對相關數(shù)據(jù)庫的分析，進一步了解ETV4在肺腺癌中的表達情況，并探討ETV4的表達對肺癌患者的影響。

1 資料與方法

1.1 資料ETV4在肺腺癌中的表達數(shù)據(jù)來源于Oncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org)，ETV4的表達與肺腺癌的臨床特征分析數(shù)據(jù)來源于UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)，肺腺癌的預后數(shù)據(jù)從Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/private)獲得，ETV4基因的變異情況及蛋白互作情況則分別通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org)及STRING網(wǎng)站(search tool for the retrieval of interacting genes)獲得。

1.2 方法

1.2.1 ETV4在肺腺癌中的表達 Oncomine數(shù)據(jù)庫是一種癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫和基于Web的數(shù)據(jù)挖掘平臺，旨在激發(fā)全基因組表達分析的新發(fā)現(xiàn)，并比較大多數(shù)主要類型癌癥與各自正常組織中的轉錄組數(shù)據(jù)[11]。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析ETV4在肺腺癌中的表達情況，具體步驟為：登錄Oncomine數(shù)據(jù)，在數(shù)據(jù)庫檢索界面中輸入篩選條件: (1)gene：ETV4； (2)analysis type：cancer vs normal analysis； (3)data type：mRNA or DNA； (4)cancer type：Lung cancer；(5)設置臨界條件為：P-VALUE：0.05，F(xiàn)OLD CHANGE：2，GENE RANK：Top 10%。在以上篩選條件下，選擇所有得到的肺腺癌數(shù)據(jù)集，并據(jù)此挑選數(shù)據(jù)分析ETV4在肺腺癌中的表達情況。

1.2.2 ETV4與肺腺癌患者臨床特征之間的關系 UALCAN數(shù)據(jù)庫是一個交互式Web資源，使研究人員能夠快速輕松地分析來自癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)的數(shù)據(jù)[12]。通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析ETV4的表達與肺腺癌患者臨床特征之間的關系，按以下步驟進行：(1)在數(shù)據(jù)庫首頁選擇TCGA analysis；(2)Enter gene symbol(s)：ETV4;(3)TCGA dataset：Lung adenocarcinoma；(4)Links for analysis：Expression。分別選擇不同的臨床特征進行分析。

1.2.3 ETV4與肺腺癌患者預后的關系 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)是一個包含基因表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的在線數(shù)據(jù)庫，覆蓋了肺癌，卵巢癌，胃癌和乳腺癌等腫瘤的基因及臨床數(shù)據(jù)[13]。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析ETV4的表達水平與肺腺癌患者預后的關系，設置主要篩選條件如下：(1)mRNA：Start KM Plotter for lung cancer；(2)Affy id/Gene symbol：ETV4；(3)Split patients by：Auto select best cutoff；(4)Survival：OS、FP、PPS；(5)Probe set options：only JetSet best probe set；(6)Histology：adenocarcinoma；(7)Cox regression：univariate；(8)Array quality control：exclude baised arrays。設置完畢后，提交檢索。

1.2.4 ETV4在肺腺癌中的突變情況及蛋白互作分析 cBioPortal數(shù)據(jù)庫主要用于探索、可視化和分析多維度癌癥基因組數(shù)據(jù)，使研究者可以交互探索不同樣本，基因，通路的遺傳學上的改變，并可以與臨床數(shù)據(jù)相結合[14]。STRING網(wǎng)站是一種在線工具，旨在評估和整合蛋白質-蛋白質相互作用信息，例如物理和功能關聯(lián)，迄今為止，STRING涵蓋了來自2,031個生物體的9,643,763個蛋白質[15]。為了進一步探討ETV4在肺腺癌中的作用，我們通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析了ETV4在肺腺癌中的突變情況，并通過STRING構建了與ETV4的蛋白互作網(wǎng)絡，分析與ETV4密切相關的基因。

1.3 統(tǒng)計學處理ETV4與肺腺癌預后之間關系的Kaplan-Meier Plotter分析采用Log-rank檢驗分析二者之間相關性，并進一步使用Cox單因素風險回歸模型分析ETV4表達是否為影響肺腺癌預后的危險因素，以P<0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 ETV4在肺腺癌中的表達在Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集與ETV4表達有關的肺癌數(shù)據(jù)28項，包含1727個樣本，包括肺癌與正常對照組之間的比較，肺癌與肺癌之間的比較等。通過篩選后，得到ETV4在肺腺癌與正常肺組織中表達分析的數(shù)據(jù)10項，發(fā)現(xiàn)在這10項數(shù)據(jù)中，來自Bhattacharjee與Weiss等人的2項數(shù)據(jù)集顯示，與正常組織相比，ETV4在肺腺癌中表達升高，但是差異沒有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.764、0.087)，其余8項數(shù)據(jù)則皆顯示，與正常肺組織相比，ETV4在肺腺癌中的表達明顯升高(P<0.05)(表1)，為總體了解與正常肺組織相比ETV4在肺腺癌中的表達情況，我們對這10項研究數(shù)據(jù)在Oncomine中進行了Meta分析，結果顯示，與對照組相比，ETV4在肺腺癌中的表達明顯升高(P<0.05)(圖1)。

表1 ETV4在不同肺腺癌數(shù)據(jù)集中的表達情況

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中多個數(shù)據(jù)集的meta分析

2.2 ETV4與肺腺癌患者臨床特征之間的關系根據(jù)ulcan數(shù)據(jù)庫檢索源自TCGA數(shù)據(jù)庫中的肺腺癌臨床數(shù)據(jù)，分析ETV4在腺癌中的表達與患者臨床特征之間的關系。結果顯示，在不同種族、性別、年齡的肺腺癌患者中，ETV4的表達未見明顯差異，此外，肺腺癌的淋巴結轉移、腫瘤分期也未見到與ETV4的表達存在明顯相關性，而吸煙習慣也并沒有影響ETV4的表達(圖2)。

圖2 ETV4的表達與胃癌患者臨床特征之間的關系

2.3 Kaplan-Meier Plotter分析ETV4與患者預后的關系通過Kaplan-Meier Plotter分析ETV4表達與胃癌患者預后的關系，結果顯示與ETV4高表達的肺腺癌患者相比，ETV4低表達患者的總生存率(Overall survival，OS)、第一次疾病進展(First progression，F(xiàn)P)、后進展生存期(Post-progression survival，PPS) 并沒有明顯改善(P值均大于0.05)，ETV4低表達患者的OS甚至相對更低(圖3)。

2.4 ETV4基因突變情況及蛋白互作網(wǎng)絡通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫選取了Lung Adenocarcinoma(Broad，Cell 2012)等5項肺腺癌數(shù)據(jù)集，包含來自1270 患者的1272個樣本(圖4A)，借此分析ETV4基因在肺腺癌中的變異情況，結果顯示，ETV4在肺腺癌中的變異率很低，僅為0.8%，主要以基因突變及基因擴增為主(圖4A、圖4B)，這說明ETV4在肺腺癌中通過基因突變發(fā)揮致癌作用的可能性很小。而通過蛋白互作網(wǎng)絡，我們發(fā)現(xiàn)與ETV4關系密切的基因不多，主要有JUN原癌基因(Jun Proto-Oncogene，JUN)、絲裂原激活蛋白激酶6(Mitogen-Activated Protein Kinase 6，MAPK6)以及跨膜絲氨酸蛋白酶2(Transmembrane Serine Protease 2，TMPRSS2)等10種基因，提示ETV4在肺腺癌中的高表達可能與這些基因相關(圖4C)。

圖3 ETV4的表達水平與肺腺癌患者OS、FP、PPS之間的關系

圖4 ETV4在肺腺癌中的突變分析及ETV4的蛋白互作網(wǎng)絡

3 討論

ETV4是新近發(fā)現(xiàn)的一種在多種腫瘤中高表達的轉錄因子，在結直腸癌、前列腺癌等腫瘤中發(fā)揮促癌作用，并被視為一種潛在的促癌因子[24]。ETV4主要通過ETS結構域與下游靶基因的啟動子相結合并發(fā)揮調節(jié)作用，進而調節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而其下游靶基因多為各類基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)，而MMP則能通過降解細胞間粘附分子以及細胞外基質，消除腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，為惡性腫瘤的侵襲轉移提供有利條件[8,25]，此外，在結直腸癌等腫瘤中，ETV4還能調節(jié)骨橋蛋白、環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)及類賴氨酸氧化酶2的表達促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,26]。相比于這些研究較為深入的腫瘤，ETV4在肺癌中受到的關注則少了許多，僅有少量相關報道，但是跟大部分腫瘤一樣，ETV4在肺癌中也呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)，且同樣能通過調節(jié)COX-2、MMP1等下游靶基因發(fā)揮促癌作用[9,27-28]，此外，Cheng T等人研究發(fā)現(xiàn)，ETV4在肺腺癌中也同樣處于高表達狀態(tài)，且能通過與RNA結合蛋白2的基因啟動子結合上調其表達，并借此促進肺腺癌的增殖及轉移[10]。

本研究通過生物信息學分析進一步驗證了ETV4在肺腺癌中的高表達，但是，ETV4的表達與肺腺癌患者的種族、年齡、吸煙史等因素并無直接關系，也未發(fā)現(xiàn)ETV4能促進肺癌轉移及惡化的證據(jù)，同時，ETV4的表達與肺腺癌患者的預后之間也沒有明顯相關性，此外，ETV4基因在肺腺癌中的變異率很低，提示ETV4在肺腺癌中的發(fā)揮致癌作用及通過基因變異途徑促癌發(fā)展的可能性較低。本研究結果可能在一定程度上會降低ETV4作為一種藥物開發(fā)靶點、肺腺癌診斷及評估標志物的潛在可能性，但也恰好說明了，ETV4在腫瘤中的研究不能一概而論，而應該針對不同腫瘤具體分析，例如在宮頸癌中，ETV4就呈現(xiàn)低表達狀態(tài)并能抑制腫瘤轉移[29]。ETV4在其他腫瘤中已經(jīng)展現(xiàn)出了其在腫瘤研究中的重要作用，并得到了一致的結論，相比之下，ETV4在肺癌乃至肺腺癌中的研究還存在較大不確定性，有待進一步深入研究，尤其是ETV4對肺腺癌的作用及作用機制，還需要在基礎、臨床實驗中進一步探討。