王青柏, 彭如群, 肖惠敏, 劉靜霞, 周少璐, 謝小保

廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心， 廣東省科學(xué)院，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

光催化材料及制品因其在光照射激發(fā)條件下產(chǎn)生催化作用，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，可以長期有效地分解有機(jī)污染物和部分無機(jī)污染物，具有廣譜抗菌、除臭、防污、分解空氣及水中有機(jī)污染物、自潔、可重復(fù)利用等特點(diǎn)，展示其在環(huán)境治理、功能建材等方面的巨大應(yīng)用前景[1-3]。目前研究較多的光催化材料有TiO2，ZnO，Cds，WO3，F(xiàn)e2O3等，其中TiO2氧化活性較高，化學(xué)穩(wěn)定性好，對(duì)人體無毒害，成本低，無污染，應(yīng)用范圍廣，因而最受重視，是目前應(yīng)用最廣泛的納米光催化材料，也是最具有開發(fā)前途的綠色環(huán)保型材料。TiO2目前廣泛應(yīng)用于光催化空氣凈化、光催化抗菌、防污自動(dòng)清潔、大氣污染治理、水處理等，如用于陶瓷，玻璃，混凝土，塑料，涂層、紙張等功能產(chǎn)品的生產(chǎn)[4,5]。

然而，光催化材料及制品的抗真菌效果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)試和評(píng)價(jià)方法。本項(xiàng)目的研究，為建立符合我國環(huán)境條件和實(shí)際應(yīng)用的紫外光響應(yīng)的光催化材料及制品抗真菌活性測(cè)試方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器和試劑

生化培養(yǎng)箱、馬鈴薯瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基，購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 3.5487、嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)CGMCC 3.8028、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231，均購自廣東省微生物菌種保藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3樣品

共收集10個(gè)光催化樣品，從光催化制品或材料上選取平整部分，切成邊長為50 mm±2 mm方塊，制備6片試樣，3片用于光照條件下測(cè)試，3片用于暗條件下測(cè)試。

采用石英玻璃片作為空白對(duì)照樣，將空白對(duì)照樣切成邊長為50 mm ±2 mm方塊(厚度小于10 mm)，制備9個(gè)空白對(duì)照樣片，其中3片用于0時(shí)間洗脫，3片用于光照測(cè)試，3片用于暗條件測(cè)試。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)菌液的制備

將黑曲霉和嗜松青霉分別接種在PDA培養(yǎng)基上28 ℃±1 ℃培養(yǎng)4 d～7 d，形成良好的孢子培養(yǎng)物后使用；將白色念珠菌接種在沙氏瓊脂培養(yǎng)基上36 ℃±1 ℃培養(yǎng)1 d后使用。

取10 mL的稀釋液倒入真菌培養(yǎng)物中，用接種環(huán)輕輕的刮取真菌及孢子，通過消毒棉或雙層紗布過濾，然后將濾液用吸管或渦旋混合器混勻。在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板或比濁法測(cè)試得到的真菌濃度，并稀釋至(2.0～5.0)×105CFU/mL的濃度。

制備好暫時(shí)不用的真菌懸液可在冰箱中(5 ℃～10 ℃)存儲(chǔ)，霉菌孢子懸液在冰箱中存儲(chǔ)時(shí)間不超過24 h，白色念珠菌懸液不超過4 h。

1.2.2接種培養(yǎng)

將空白對(duì)照樣片和光催化樣片分別放入潔凈的培養(yǎng)皿中，試驗(yàn)面朝上。用移液管吸取0.2 mL的1.2.1制備的菌液，滴加到每個(gè)試樣的表面，然后用聚乙烯薄膜(40 mm×40 mm)覆蓋。調(diào)節(jié)薄膜使菌液在樣片和薄膜之間分散均勻。注意不要將菌液溢出。

1.2.3培養(yǎng)皿中樣片的放置

保濕濾紙鋪在培養(yǎng)皿的底部，用適量的無菌水(5 mL～10 mL)浸泡濾紙，然后將玻璃棒置于濾紙上面。將已接種的樣片和薄膜小心放在玻璃棒上，用玻璃板蓋住培養(yǎng)皿。除了帶有薄膜的樣片外，所有培養(yǎng)皿里的用品都應(yīng)經(jīng)過高壓蒸汽滅菌。

1.2.4光照培養(yǎng)

打開光源，穩(wěn)定30 min，然后調(diào)節(jié)燈管位置或功率調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。將需要光照的接種樣片(3片光催化樣片，3片空白對(duì)照樣片)置于0.4 mW/cm2～0.8 mW/cm2的紫外光照射培養(yǎng)38 h ±2 h，控制溫度在25 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度不低于85%。

將3個(gè)光催化樣片、3個(gè)空白對(duì)照樣片置于暗條件下，暗條件的培養(yǎng)溫度控制在25 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度不低于85%，持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間等同光照條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 光源

國際上紫外光光響應(yīng)的光催化產(chǎn)品使用波長一般使用351 nm和365 nm熒光作為激發(fā)光源[6]，用對(duì)照樣片測(cè)試波長對(duì)真菌孢子或細(xì)胞的影響，結(jié)果見表1。

表1 紫外波長對(duì)真菌孢子或細(xì)胞的影響

從表1結(jié)果可以看出，351 nm和365 nm熒光對(duì)測(cè)試菌沒有影響，說明365 nm熒光既可以激發(fā)光催化材料的催化抗菌活性而本身沒有殺菌性能，參考國家標(biāo)準(zhǔn)“GB/T 23763—2009光催化抗菌材料及制品 抗菌性能的評(píng)價(jià)”[7]，本標(biāo)準(zhǔn)選擇365 nm熒光作為紫外光源。

2.2 光照強(qiáng)度

本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了光照強(qiáng)度對(duì)真菌孢子或細(xì)胞的影響，結(jié)果見表2。

表2 光照強(qiáng)度對(duì)真菌孢子或細(xì)胞的影響

從表2結(jié)果可以看出，0.4 mW/cm2和0.8 mW/cm2光照強(qiáng)度對(duì)測(cè)試菌沒有影響，本標(biāo)準(zhǔn)選擇0.4 mW/cm2至0.8 mW/cm2作為紫外光光照強(qiáng)度進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 光照時(shí)間

光照強(qiáng)度采用0.8 mW/cm2，光照處理時(shí)間對(duì)抗真菌試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果見表3。

表3結(jié)果顯示光照24 h抗真菌結(jié)果較差，光催化材料的抗真菌活性還沒有充分發(fā)揮作用，光照48 h測(cè)試結(jié)果都具有抗菌效果，但樣品間的結(jié)果區(qū)分度差，而光照38 h測(cè)試結(jié)果的區(qū)分度較好，測(cè)試結(jié)果也穩(wěn)定。因此，光照時(shí)間采用38 h最合適。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1檢測(cè)人員比對(duì)試驗(yàn)

根據(jù)確定的試驗(yàn)方法進(jìn)行了檢測(cè)人員比對(duì)試驗(yàn)，以考核實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性，檢測(cè)結(jié)果表明不同的檢測(cè)人員對(duì)同一樣品測(cè)試結(jié)果的重復(fù)性較好。人員比對(duì)測(cè)試結(jié)果見表4。

表3 光照時(shí)間對(duì)真菌孢子或細(xì)胞的影響

表4 不同檢測(cè)人員的比對(duì)試驗(yàn)

2.4.2實(shí)驗(yàn)室比對(duì)試驗(yàn)

同時(shí)依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)方法，廣東省微生物研究所和中科院理化所抗菌檢測(cè)中心兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室，使用不同儀器進(jìn)行了比對(duì)試驗(yàn)，比對(duì)結(jié)果表明(表5)，2個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的重現(xiàn)性較好，結(jié)果相差在誤差范圍內(nèi)(微生物的實(shí)驗(yàn)誤差在15%以內(nèi))，試驗(yàn)方法的再現(xiàn)性好，符合微生物抗菌實(shí)驗(yàn)的相關(guān)要求。

3 結(jié)論

本研究以黑曲霉、嗜松青霉、白色念珠菌為測(cè)試菌種，真菌細(xì)胞或孢子濃度濃度為(2.0～5.0)×105CFU/mL條件下，確定了波長365 nm、輻照強(qiáng)度0.4 mW/cm2至0.8 mW/cm2、光照孵育時(shí)間38 h為光催化材料及制品抗真菌性能測(cè)試的最佳條件，并對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性和再現(xiàn)性良好，為國家標(biāo)準(zhǔn)“GB/T37247—2018光催化材料及制品抗真菌性能測(cè)試方法及評(píng)價(jià)”[8]的制定提供技術(shù)了科學(xué)依據(jù)。

表5 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)試驗(yàn)