李 宇， 江 勇， 楊 琳， 謝穎瑋

3M中國有限公司, 上海 200233

細(xì)菌生物膜是粘附于載體表面，由細(xì)菌和自身分泌的胞外基質(zhì)形成的一種膜結(jié)構(gòu)，其主要成分為胞外多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，能夠極大的增強(qiáng)細(xì)菌的抗藥性和抗免疫能力等[1-3]。因此如何有效地檢測生物膜去除效率一直是生物醫(yī)學(xué)界和食品工業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[4-6]。目前，針對生物膜去除效率的評價(jià)主要通過統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)目的變化來反映[4,5]，其局限性是很明顯的，即細(xì)菌的滅殺效率并不能完全等同于生物膜的去除效率，細(xì)菌被殺死并不意味著生物膜被破壞和去除。因此開發(fā)一種新的生物膜含量的評價(jià)方法，對更直觀和科學(xué)地表征生物膜危害的防治效果將更具有實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

多糖作為生物膜的主要成分之一，對其的研究一直以來備受關(guān)注[7-9]。在一定程度上，多糖的存在也能夠作為生物膜存在的重要標(biāo)志。在本研究中，我們通過檢測消毒劑作用前后細(xì)菌生物膜中多糖含量的變化來反映生物膜的去除效率，從而為發(fā)展新的生物膜去除效率檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)(UV-VIS)；電加熱板；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；安捷倫1100 凝膠滲透色譜儀(GPC)；色譜柱(HSPgel 3.0+HSPgel 5.0)；CDC生物膜反應(yīng)器；磁力攪拌器等。

1.2 試劑

三氟乙酸；苯酚；濃硫酸；馬鈴薯淀粉；3M Avagard9250消毒劑；3M Avagard9206消毒劑等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)菌準(zhǔn)備

在無菌條件下，挑取3～5個(gè)生長良好的銅綠假單孢桿菌(ATCC 15442)典型菌落放入100 mL無菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)中(300 mg/L)，在(35±2) ℃振蕩過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，菌液濃度需達(dá)到108CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2生物膜培養(yǎng)

按ASTM E2562的要求搭建生物膜反應(yīng)器模型[10]。在主反應(yīng)器中加入無菌TSB(300 mg/L)培養(yǎng)液500 mL。在主反應(yīng)器中接種1 mL培養(yǎng)好的菌液，打開磁力攪拌器，使主反應(yīng)器中的培養(yǎng)體系的轉(zhuǎn)速控制在125 r/min，將生物膜反應(yīng)器放在室溫下(21±2) ℃過夜培養(yǎng)24 h。連接20 L TSB(100 mg/L)補(bǔ)液桶，以(11.7±0.2) mL/min的流速向主反應(yīng)器補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)打開主反應(yīng)器的排液管，使多余的培養(yǎng)液流出反應(yīng)器。補(bǔ)液培養(yǎng)過程持續(xù)24 h后，關(guān)閉所有反應(yīng)器，取出生長好的生物膜片備用。

1.3.3消毒劑殺菌試驗(yàn)

用20 mL無菌水清洗培養(yǎng)好的生物膜片，去除殘留在表面的游離細(xì)菌。隨后將清洗好的生物膜片放入50 mL離心管中，加入4 mL消毒劑，作用3 min后，立即向50 mL離心管中加入36 mL中和劑進(jìn)行中和，充分振蕩超聲后，取菌懸液以10倍梯度稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.4水解方法及水解效率評估方法

取1片生長良好的生物膜片放入20 mL生理鹽水中，充分的振蕩洗脫后制成20 mL生物膜懸液，加入4 mol/L 三氟乙酸溶液10 mL[11]，在110 ℃下加熱4 h進(jìn)行水解，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至快干，獲得樣品濃縮液。

水解效率的評估主要通過安捷倫凝膠滲透色譜儀(GPC)來進(jìn)行。對于水解前樣品，直接取1 mL樣品溶液，用0.45 μm濾膜過濾于樣品瓶中，進(jìn)行凝膠滲透色譜(GPC)測試。對于水解后樣品，取1 mL樣品濃縮液，緩慢滴加三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH至7.0左右，然后同樣用0.45 μm濾膜過濾于樣品瓶中，進(jìn)行GPC測試。GPC測試條件為：流動(dòng)相為水，選用的色譜柱為HSPgel3.0 + HSPgel5.0 (6.0×150 mm)，柱溫40 ℃，流速控制為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為2.0 μL，運(yùn)行時(shí)間為20 min。

1.3.5多糖水解后的單糖含量測定方法

分別取500 μL生物膜樣品濃縮液和馬鈴薯標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液于4 mL樣品瓶中，加入 500 μL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚溶液，混合均勻后加入2.5 mL 濃硫酸，待溶液冷卻至室溫后，取溶液200 μL于96位孔板中，通過紫外可見分光光度計(jì)，于490 nm波長處測定溶液的吸光度[12]。結(jié)合馬鈴薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到水解后的單糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌效率

使用兩種不同的消毒劑(3M Avagard9250和3M Avagard9206)進(jìn)行殺菌處理，處理前后菌液濃度的變化以及計(jì)算得到的相應(yīng)殺菌效率如表1所示。每種消毒劑重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)，兩種消毒劑的殺菌效率都達(dá)到了99%以上，呈現(xiàn)出較好的殺菌效果，如以此殺菌效率作為生物膜的去除效率，則說明生物膜已經(jīng)在很大程度上被破壞并去除。

2.2 生物膜定量檢測

2.2.1水解結(jié)果

表1 消毒劑殺菌效果表

馬鈴薯淀粉溶液水解前后的GPC譜圖如圖1和圖2所示。同時(shí)隨機(jī)選取一組生物膜樣品，其水解前后的GPC譜圖如圖3和圖4所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，對于馬鈴薯淀粉和生物膜樣品，水解前GPC圖譜中僅有分子量大的物質(zhì)存在(保留時(shí)間短)，水解后，分子量大的化合物消失，而具有小分子量的物質(zhì)(保留時(shí)間長)出現(xiàn)，說明了水解過程的完全，生物膜和馬鈴薯淀粉中的多糖等大分子物質(zhì)被水解為單糖等小分子物質(zhì)，獲得了預(yù)期的水解效果，為多糖的定量分析提供了依據(jù)和可行性。

圖1 馬鈴薯淀粉溶液水解前GPC圖譜

2.2.2多糖定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

稱取馬鈴薯淀粉對照品5 mg(精確至0.000 1g)，置10 mL容量瓶，加水溶解，稀釋至刻度。 分別移取此馬鈴薯溶液0 mL、0.4 mL、1.0 mL和2.0 mL，置10 mL樣品瓶中，用水稀釋至刻度。按照1.3.4中水解方法對馬鈴薯稀釋液進(jìn)行水解濃縮。

圖3 生物膜樣品水解前GPC圖譜

圖4 生物膜樣品水解后GPC圖譜

水解完成后，通過紫外可見分光光度計(jì)測定各馬鈴薯稀釋液的吸光度, 以馬鈴薯溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示，將依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線對生物膜中的多糖含量進(jìn)行定量。

圖5 馬鈴薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3多糖含量測定結(jié)果

將生物膜樣品分成A,B 兩組，每組包含三個(gè)培養(yǎng)良好的生物膜片，每組中各選取一個(gè)生物膜片作為參考樣，分別對其進(jìn)行水解并測定其吸光度。A組其余兩個(gè)生物膜片通過3M Avagard9250消毒劑進(jìn)行殺菌，同時(shí)B組其余兩個(gè)生物膜片則通過3M Avagard9206消毒劑進(jìn)行滅菌，然后將所有消毒劑處理過的樣品分別進(jìn)行水解，測定其吸光度。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計(jì)算我們得到了兩組生物膜樣品中的多糖含量，以及消毒劑作用前后多糖含量的變化，從而更為直觀地展示了生物膜含量的變化以及據(jù)此計(jì)算得到生物膜的去除效率，結(jié)果如表2所示。通過對比傳統(tǒng)數(shù)菌方法(表1)與本研究中的方法，可以發(fā)現(xiàn)，以多糖含量的變化計(jì)算得到的生物膜去除效率遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)數(shù)菌方法，說明即使細(xì)菌被充分滅殺，生物膜依然能夠較大程度地保留。

表2 消毒劑作用前后多糖含量變化表

3 結(jié)論

本研究通過檢測消毒劑作用前后生物膜中多糖含量的變化來反映生物膜的去除效率，并與傳統(tǒng)的數(shù)菌方法進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)以細(xì)菌的滅殺效率來反映生物膜的去除效率是不完善的，生物膜作為細(xì)菌的載體，通過消毒劑很難將其徹底去除，生物膜的去除以及去除效率的檢測都需要更為有效的手段來完成。