孟 軍， 季小榮， 周 瑋， 朱曉軍， 華書玫， 李金明， 管 錦

江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院， 江蘇 南京 210007

在大氣污染日益嚴(yán)重的今天，隨著公眾對(duì)空氣污染關(guān)注度的上升，越來(lái)越多的家庭選擇使用空氣凈化器[1]。目前，大多數(shù)家庭使用的是HEPA濾網(wǎng)(高效過(guò)濾器)空氣凈化器。HEPA濾網(wǎng)由于其孔徑細(xì)微，在空氣凈化器運(yùn)行時(shí)，空氣中絕大多數(shù)直徑微小的顆粒被吸附在濾網(wǎng)上，這些直徑微小的顆粒中相當(dāng)大一部分為環(huán)境中各種微生物。隨著使用時(shí)間的積累，空氣中大量灰塵會(huì)在濾網(wǎng)上聚集，灰塵中含有微生物生長(zhǎng)所必需的碳氮源，加上機(jī)器本身加濕功能所提供的水分，為微生物生長(zhǎng)提供了絕佳生長(zhǎng)環(huán)境[2]。微生物的大量繁殖，不僅影響凈化器功能，甚至還會(huì)提高室內(nèi)空氣被有害微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)[3]，給人體健康帶來(lái)危害。呼吸道感染是臨床最常見的疾病之一，引起呼吸道疾病的病原物包括真菌、細(xì)菌、病毒和支原體等，但絕大多數(shù)呼吸道感染是由病毒引起[4]。通常病毒檢測(cè)采用培養(yǎng)和血清學(xué)方法，但由于上述兩種技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)技術(shù)要求高，因此難以對(duì)病毒進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)[5]。熒光定量PCR法雖然在一定程度上解決了傳統(tǒng)方法的時(shí)效問(wèn)題，但也存在著成本高、檢測(cè)通量低等問(wèn)題[6]。微流體核酸檢測(cè)芯片是近年來(lái)出現(xiàn)的一種將微流控技術(shù)和生物芯片相結(jié)合對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)的新技術(shù)，具有高通量、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[7]。目前，微流體芯片檢測(cè)技術(shù)已用于癌癥研究[8]、呼吸道病原物檢測(cè)[9]。家用空氣凈化器在使用過(guò)程中，空氣中的各種固態(tài)、氣態(tài)顆粒物以及微生物在濾網(wǎng)中長(zhǎng)期積累，污染嚴(yán)重，難以采用傳統(tǒng)培養(yǎng)、常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)其中微生物種群進(jìn)行準(zhǔn)確分析。目前，對(duì)空氣凈化器濾網(wǎng)上微生物的研究主要集中于細(xì)菌和霉菌方面[10,11]，對(duì)病毒的相關(guān)研究報(bào)道較少，缺乏濾網(wǎng)中微生物種群整體全面分析。本研究通過(guò)調(diào)查家用空氣凈化器基本使用情況，以HEPA濾網(wǎng)為研究對(duì)象，采用微流體芯片核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)HEPA濾網(wǎng)中呼吸道病原物種類進(jìn)行分析，了解家用空氣凈化器HEPA濾網(wǎng)中呼吸道病原物種群分布情況，為用戶合理使用空氣凈化器提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1HEPA濾網(wǎng)

采用自愿的方式，在南京市某單位收集家庭及辦公場(chǎng)所空氣凈化器中HEPA濾網(wǎng)，記錄品牌、型號(hào)、使用時(shí)間和場(chǎng)所。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

ABI Q7+熒光定量PCR儀，Nanodrop分光光度計(jì)，Eppendorf 5418 R型高速冷凍離心機(jī)，渦旋混合儀，Eppendorf微量移液器。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑

Geno Tube Livestock拭子棒，貨號(hào)：FX 190208V01；MagMAX CORE 核酸提取試劑盒：賽默飛公司，貨號(hào)：A 32700；TaqManTMArray Respiratory Tract Microbiota Comprehensive Card呼吸道病菌微流體芯片，賽默飛公司，貨號(hào)：A 41238；TaqMan?Fast Virus 1-Step Master Mix預(yù)混液，賽默飛公司，貨號(hào)：4444432；PBS緩沖液，無(wú)核酸酶水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HEPA濾網(wǎng)中呼吸道病原物樣本采集

使用拭子棒在收集到的HEPA濾網(wǎng)前后中央部位(對(duì)角線交叉點(diǎn))8 cm×8 cm均勻涂抹5～10次，作為1個(gè)分析樣本。

1.2.2病原物核酸提取

將已采集樣本的拭子棒前段棉簽部位剪斷，放在盛有1 mL pH 7.4 PBS緩沖液離心管渦旋3 min，使樣本材料盡量懸于PBS緩沖液中，丟棄拭子棒。按照MagMAX CORE 核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取步驟提取核酸。

1.2.3核酸濃度、純度檢測(cè)

采用Nanodrop紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度和純度。

1.2.4呼吸道病原物檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系：TaqMan?Fast Virus 1-Step 預(yù)混液25 μL，待測(cè)樣本核酸提取液45 μL，無(wú)核酸酶水30 μL，配制成100 μL反應(yīng)體系。用微量移液器將配制好的100 μL的反應(yīng)體系加入到TaqManTMArray Respiratory Tract Microbiota Comprehensive Card芯片的加樣孔，采用ABI Q7+熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min，2 ℃/min升溫至50 ℃，保持15 min，2 ℃/min升溫至95 ℃，保持10 min，1.5 ℃/min降溫至60 ℃，保持1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

采用ABI Q7+熒光定量PCR儀自帶的QuantStudioTMReal-Time PCR Software對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，Ct值≤35視為陽(yáng)性樣本。

2 結(jié)果與討論

2.1 空氣凈化器基本情況

本次研究共收集了61臺(tái)空氣凈化器中的HEPA濾網(wǎng)，涉及18個(gè)品牌25個(gè)型號(hào)，濾網(wǎng)實(shí)際使用時(shí)間在60 d～200 d之間，使用場(chǎng)所包括家用客廳、臥室和辦公室。詳細(xì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 空氣凈化器基本情況

本研究共涉及18個(gè)品牌25個(gè)型號(hào)家用空氣凈化器，基本涵蓋了目前市場(chǎng)上常見家用空氣凈化器品牌。從使用場(chǎng)所來(lái)看，臥室使用率占比最高，占本次研究樣本使用場(chǎng)所的52.5%。從實(shí)際使用時(shí)間來(lái)看，90 d～120 d占比最高，為52.5%。

2.2 HEPA濾網(wǎng)中呼吸道病原物種類分析

采用微流體芯片核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)61臺(tái)家用空氣凈化器中HEPA濾網(wǎng)中44種呼吸道病原物進(jìn)行了分析。分析過(guò)程中，每塊微流體芯片均使用18S rDNA作為質(zhì)控樣本，以驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系和程序的適用性。同時(shí)設(shè)置以無(wú)核酸酶水為擴(kuò)增模板的陰性對(duì)照以監(jiān)測(cè)操作過(guò)程中是否有外來(lái)核酸污染。Ct值≤35擴(kuò)增結(jié)果認(rèn)定為陽(yáng)性樣本。

61個(gè)樣本中，有21個(gè)樣本檢測(cè)出不同種類呼吸道病原物，病原物陽(yáng)性樣本檢出率為34.4%。在21個(gè)陽(yáng)性樣本中，共檢出呼吸道病原物8種，占檢測(cè)病原物總種類的18.2%。在使用場(chǎng)所上，3個(gè)使用場(chǎng)所均有陽(yáng)性樣本檢出，其中辦公室來(lái)源樣本陽(yáng)性檢出率最高，共有12個(gè)樣本檢出呼吸道病原物，占陽(yáng)性檢出樣本總量的57.1%。詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.3 討論

在霧霾天氣時(shí)，大氣懸浮顆粒物中微生物種類高達(dá)1 300多種，其中大部分微生物不致病，但也包含可經(jīng)呼吸道傳播的致病微生物[12]。各種呼吸道病原物是引起流感、腮腺炎、哮喘等疾病的主要病原物[13]?？諝鈨艋鳛V網(wǎng)在過(guò)濾空氣的過(guò)程中，會(huì)使微生物在濾網(wǎng)上不斷聚集[10]，非常容易跟隨空氣凈

表2 HEPA濾網(wǎng)中呼吸道病原物陽(yáng)性樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果

化器氣流進(jìn)入室內(nèi)空氣，造成二次污染。本研究對(duì)不同場(chǎng)所來(lái)源的61臺(tái)家用空氣凈化器HEPA濾網(wǎng)中呼吸道病原物進(jìn)行了分析，在21個(gè)樣本中共檢出8種常見呼吸道病原物，分別為金黃色葡萄球菌、鼻病毒A、鼻病毒B、腺病毒A、腮腺炎病毒、巨細(xì)胞病毒、卡他莫拉氏菌和肺炎克雷伯菌。金黃色葡萄球菌是引起下呼吸道感染的主要病原物之一[14]，腮腺炎病毒則會(huì)引起腮腺炎。在我國(guó)，流行性腮腺炎發(fā)病率一直居高不下，每年均有數(shù)十萬(wàn)流腮病例報(bào)告和數(shù)百起突發(fā)公共衛(wèi)生事件發(fā)生[15]。鼻病毒、腺病毒、巨細(xì)胞病毒也是最常見誘發(fā)急性呼吸道感染的病原物[16]。因此，家用空氣凈化器濾網(wǎng)的衛(wèi)生狀況應(yīng)該引起高度關(guān)注。

已有研究表明，在人員聚集的公共場(chǎng)所空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)中微生物污染嚴(yán)重[17]，在本研究檢出的21個(gè)陽(yáng)性樣本中，有12個(gè)樣本來(lái)源于辦公室，這可能與辦公室人員密度相對(duì)較大、組成復(fù)雜有一定相關(guān)性。馬聰興等[11]研究發(fā)現(xiàn)，家用空氣凈化器濾網(wǎng)上霉菌數(shù)量與實(shí)際使用時(shí)間呈正相關(guān)，而與保養(yǎng)清潔呈負(fù)相關(guān)。在本研究檢出的21個(gè)病原物陽(yáng)性樣本中，有17個(gè)樣本實(shí)際使用時(shí)間超過(guò)了100 d，3個(gè)樣本實(shí)際使用時(shí)間在90 d～100 d之間，僅有1個(gè)樣本實(shí)際使用時(shí)間小于90 d，這表明呼吸道傳播病原微生物檢出率與濾網(wǎng)實(shí)際使用時(shí)間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)。因此，定期清潔或更換濾網(wǎng)，是減少濾網(wǎng)病原微生物富集，避免產(chǎn)生二次污染的重要手段。

本研究采用微流體芯片核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)家用空氣凈化器HEPA濾網(wǎng)中呼吸道病原微生物進(jìn)行了分析，該芯片可同時(shí)檢測(cè)44種呼吸道病原物，包括31種病毒、10種細(xì)菌、1種支原體、1種衣原體和1種寄生蟲。在本研究中，共檢出6種病毒和2種細(xì)菌，病原物種類檢出率相對(duì)較低。在采用微流體芯片檢測(cè)過(guò)程中，出現(xiàn)很多Ct值大于35的可疑位點(diǎn)。Ct值是反應(yīng)核酸擴(kuò)增效率的指數(shù)，Ct值大于35的擴(kuò)增位點(diǎn)，理論上認(rèn)為該擴(kuò)增位點(diǎn)核酸模板起始拷貝數(shù)小于1，可認(rèn)為無(wú)意義。因此在本研究中，未將在核酸擴(kuò)增過(guò)程中Ct值大于35的無(wú)意義位點(diǎn)列入最終檢出病原物種類統(tǒng)計(jì)。分析原因可能是所采集的樣本中微生物量較少，提取得到的核酸濃度較低、純度不高。在今后類似的研究中，對(duì)于核酸濃度較低或者純度不佳的樣本，如何進(jìn)一步改進(jìn)采樣方式、提高核酸提取效率，以更加全面準(zhǔn)確對(duì)樣本中微生物種群進(jìn)行分析，是值得關(guān)注的問(wèn)題。受限于相應(yīng)分析規(guī)范與檢測(cè)技術(shù)的不足，目前對(duì)于呼吸道病原物在環(huán)境介質(zhì)中賦存行為的研究較少，因此，開發(fā)相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)和分析方法，對(duì)呼吸道病原物在環(huán)境介質(zhì)中種類分布、傳播途徑、生存周期等行為進(jìn)行全面解析，這對(duì)呼吸道疾病防控工作具有重要意義。

3 結(jié)論

通過(guò)采用微流體芯片核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)61個(gè)家用空氣凈化器HEPA濾網(wǎng)樣本中呼吸道病原物種類進(jìn)行分析，表明濾網(wǎng)中呼吸道病菌檢出率與使用場(chǎng)所、使用時(shí)間存在一定相關(guān)性，使用場(chǎng)所為公眾場(chǎng)所、使用時(shí)間較長(zhǎng)而未更換或未進(jìn)行清潔的濾網(wǎng)中病原物檢出概率更高。目前，關(guān)于空氣凈化器性能檢測(cè)研究主要集中于固態(tài)顆粒物、氣態(tài)污染物的凈化效果方面[18-20]，微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法相對(duì)較少[21]，GB/T 18801—2015《空氣凈化器》也未對(duì)使用過(guò)程中濾網(wǎng)衛(wèi)生問(wèn)題進(jìn)行規(guī)定[22]。因此，建議相關(guān)部門在今后制定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)加入空氣凈化器濾網(wǎng)使用過(guò)程中的相關(guān)衛(wèi)生指標(biāo)，為用戶更加合理使用空氣凈化器提供依據(jù)。