張 楠， 孫西同， 李 僉*， 田 晶， 費(fèi) 旭， 詹宏磊， 鄭欣雨

1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034； 2.大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116034； 3.大連工業(yè)大學(xué) 分析測(cè)試中心，遼寧 大連 116034

柚苷酶(Naringinase)是由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21)組成的復(fù)合酶，柚皮苷是一種類(lèi)二氫黃酮類(lèi)化合物，是果汁中重要的苦味物質(zhì)，還是枳實(shí)、化橘紅等幾味中藥的主要有效成分[1]。柚苷酶是一種專(zhuān)一水解柚皮苷的食品工業(yè)酶制劑，柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的作用下被水解成普魯寧和鼠李糖，普魯寧在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被水解成柚皮素和葡萄糖[2]。因此柚苷酶在果汁脫苦[3]、葡萄酒增香[4]、普魯寧制備[5]、黃酮類(lèi)轉(zhuǎn)化[6]、鼠李糖制備[7]以及糖蛋白去硝基化[8]等方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值。柚苷酶純品價(jià)格昂貴，不適用于大規(guī)模使用，所以工業(yè)化制備柚苷酶擁有廣闊的研究前景。

工業(yè)上生產(chǎn)柚苷酶主要有兩種途徑：包括固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵是指發(fā)酵培養(yǎng)基中沒(méi)有或基本沒(méi)有游離水的存在的發(fā)酵方式，其原料大多為天然基質(zhì)或果渣。和液態(tài)發(fā)酵相比柚苷酶的固態(tài)發(fā)酵的研究較少，但由于其原料廣泛易得、發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的能耗少、且產(chǎn)物污染小、不易污染環(huán)境的特點(diǎn)[9]，固態(tài)發(fā)酵仍具有很大的研究?jī)r(jià)值。胡奎等[10]采用曲霉SN90進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶，得到最高產(chǎn)酶量1 282 U/mL；張怡等[11]采用A-13-62固態(tài)發(fā)酵柚苷酶在培養(yǎng)基初始pH為5.0、溫度30 ℃的條件下最高產(chǎn)酶量為1 017 U/mL。我國(guó)是柑橘類(lèi)水果的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，隨之也會(huì)產(chǎn)生大量的果皮、果渣。本文章以柑橘類(lèi)果皮為發(fā)酵原料進(jìn)行黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的研究，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基等參數(shù)優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

菌株：黑曲霉FFCC uv-11由本實(shí)驗(yàn)室自主保藏

材料：柚皮苷(≥98%)，寶雞市方晟生物開(kāi)發(fā)有限公司；氯化鉀(KCl)、硝酸鈉(NaNO3)、蔗糖、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、一縮二乙二醇(DEG)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4Cl)，均為AR，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；檸檬酸、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、七水合硫酸亞鐵(Fe2SO4·7H2O)、蛋白胨，AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；橙皮、麩皮，實(shí)驗(yàn)室自主保存。

儀器：DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SpectraMaxRPlus384型酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；iCEN-24R高速冷凍離心機(jī)，杭州奧盛儀器有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-25ODE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

斜面培養(yǎng)基(g/L)[12]：3.0 g NaNO3、0.5 g KCl、30 g蔗糖、2.0 g柚皮苷、0.11 g FeSO4·7H2O、1.0 g K2HPO4、1.0 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、6 g瓊脂粉，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化

取出4 ℃下的黑曲霉菌種，在無(wú)菌環(huán)境下在斜面培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，然后培養(yǎng)箱30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，得到成熟的孢子，用無(wú)菌0.9%生理鹽水洗孢子并用無(wú)菌生理鹽水將OD600值調(diào)節(jié)至2.0 (1×108個(gè)孢子/mL)，即得到孢子懸液[12]。

1.2.2發(fā)酵液的獲得

首先制備固態(tài)培養(yǎng)基，在250 mL錐形瓶中加入一定量的麩皮、橙皮粉、氮源等，密封瓶口，121 ℃滅菌20 min。然后在無(wú)菌環(huán)境下接入一定量孢子懸液，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)8 d。在每個(gè)發(fā)酵瓶中加入100 mL的檸檬酸緩沖液(pH 5.0，0.01 mol/L檸檬酸-0.02 mol/L磷酸氫二鈉)，30 ℃、140 r/min條件下?lián)u床內(nèi)振蕩90 min，過(guò)濾，在4 ℃冷凍離心機(jī)里離心20 min，得到柚苷酶發(fā)酵液[13]。

1.2.3接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶酶活力的影響

在250 mL錐形瓶中添加3.0 g橙皮粉，2.5 g麩皮粉，0.5 g (NH4)2SO4，15 mL去離子水制成固態(tài)培養(yǎng)基，將固態(tài)培養(yǎng)基滅菌，冷卻到室溫，然后按固態(tài)培養(yǎng)基中水分含量的4%、6%、8%、10%(v/v)添加孢子懸液，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)8 d測(cè)柚苷酶酶活力。

1.2.4固液比對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶酶活力的影響

在250 mL錐形瓶中加入3.0 g橙皮粉，2.5 g麩皮粉，0.5 g (NH4)2SO4，再按照固液比為1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3和1∶3.5的比例加入去離子水。然后滅菌冷卻到室溫，加入等量的孢子懸液，30 ℃恒溫培養(yǎng)8 d測(cè)柚苷酶酶活力。

1.2.5誘導(dǎo)劑與疏松劑的比例對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶酶活力的影響

采用橙皮粉為誘導(dǎo)劑，麩皮粉為疏松劑，保持橙皮粉和麩皮粉的總質(zhì)量為5.5 g，改變橙皮粉和麩皮粉的比例為2∶3.5、2.5∶3、3∶2.5、3.5∶2和4∶1.5，然后向250 mL三角瓶中加入0.5 g (NH4)2SO4和15 mL去離子水，在121 ℃滅菌20 min，冷卻，再加入等量的孢子懸液，30 ℃恒溫培養(yǎng)8 d測(cè)柚苷酶酶活力。

1.2.6氮源種類(lèi)對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶酶活力的影響

選取NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、 NH4NO3和蛋白胨這五種氮源分別添加在固態(tài)培養(yǎng)基中，然后加入3.0 g橙皮粉、2.5 g麩皮粉、15 mL去離子水滅菌,冷卻，加入等量的孢子懸液，恒溫培養(yǎng)8 d，測(cè)柚苷酶酶活力。

1.2.7正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)影響黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從每個(gè)因素中選取了3個(gè)具有代表性的條件，設(shè)計(jì)了L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)因素表，探究最佳的柚苷酶發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶條件。

1.2.8柚苷酶酶活力的測(cè)定

采用改進(jìn)的Davis[14-17]法：稱(chēng)取30 mg固定化柚苷酶或0.2 mL游離柚苷酶與0.8 mL的柚皮苷溶液(0.8 mg/mL)混合均勻，將其放入50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，在試管中加入5 mL一縮二乙二醇(體積分?jǐn)?shù)為90%)和0.1 mL NaOH溶液(4mol/L)，取0.1 mL反應(yīng)酶解液，加入上述試管中，將三者混合均勻，室溫下靜置10 min，于420 nm處測(cè)定混合溶液的吸光值。

柚苷酶酶活力(U)的定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，在1 min里柚苷酶降解1 μg柚皮苷所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。酶比活力(U/g或U/mL)的定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，1 g固定化柚苷酶(或1 mL游離柚苷酶)所表現(xiàn)出的酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

在發(fā)酵生產(chǎn)中通常采用增加一定程度的接種量來(lái)縮短微生物的發(fā)酵周期，所以選擇一個(gè)適合的接種量對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶是很有必要的。如圖1所示，接種量從4%增大到10%時(shí)，由于接種量增大，導(dǎo)致生物量增大[18]，因此柚苷酶酶活力增加；當(dāng)接種量增加到10%時(shí)，柚苷酶酶活力達(dá)到最大，最高酶活力為15 526.75 U/g。說(shuō)明接種量為10%(v/v)是黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶最佳條件，接種量再增加時(shí)，發(fā)酵所需的營(yíng)養(yǎng)過(guò)快的被消耗[19]，從而導(dǎo)致柚苷酶酶活力有所下降。此結(jié)論與RAMACHANDRAN等[20]報(bào)道的結(jié)論相一致。

圖1 接種量對(duì)柚苷酶酶活力的影響

2.2 固液比對(duì)固態(tài)發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基為沒(méi)有或基本沒(méi)有游離水的固態(tài)基質(zhì)，但是此種固態(tài)基質(zhì)需要足夠的濕度[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)固液比在1∶1.5時(shí)柚苷酶酶活力最低，為4 915.64 U/g。這是由于較低的固液比會(huì)降低培養(yǎng)基的多孔性，從而使底物內(nèi)氣體體積和氣體交換減少，還會(huì)很大程度的發(fā)生雜菌污染的情況。隨著固液比的增加，柚苷酶酶活力也隨著增加[22]，固液比達(dá)到1∶2.5時(shí)柚苷酶酶活力最高，最高酶活力為15 526.75 U/g，因?yàn)楣桃罕仍龃?，培養(yǎng)基內(nèi)水分降低，會(huì)使發(fā)酵中所需的水分不足，底物膨脹度低，減緩菌株的生長(zhǎng)速度[23]。

圖2 固液比對(duì)柚苷酶酶活力的影響

2.3 誘導(dǎo)劑與疏松劑的比例對(duì)固態(tài)發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

誘導(dǎo)劑是指在發(fā)酵過(guò)程中起誘導(dǎo)作用的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，它不能被酶所利用。因?yàn)槌绕し圩鳛檎T導(dǎo)劑會(huì)誘導(dǎo)黑曲霉的發(fā)酵，同時(shí)橙皮粉中還含有大量的柚皮苷，柚皮苷在黑曲霉發(fā)酵中作為碳源會(huì)給黑曲霉的發(fā)酵提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)黑曲霉的生長(zhǎng)提高柚苷酶酶活力。而疏松劑起到疏松底物培養(yǎng)基、給黑曲霉的發(fā)酵提供氣體體積的作用[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)劑與疏松劑比例為3∶2.5時(shí)柚苷酶酶活力最好，當(dāng)疏松劑過(guò)多、誘導(dǎo)劑過(guò)低時(shí)，會(huì)減緩黑曲霉的發(fā)酵同時(shí)提供不了柚苷酶發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致柚苷酶酶活降低。當(dāng)誘導(dǎo)劑過(guò)多、疏松劑過(guò)少時(shí)，底物的多孔性降低，瓶?jī)?nèi)的氣體交換減少，導(dǎo)致柚苷酶酶活力降低[22]。因此選擇誘導(dǎo)劑與疏松劑比例3∶2.5為較適宜的條件。

圖3 誘導(dǎo)劑與疏松劑的比例對(duì)柚苷酶 酶活力的影響

2.4 氮源種類(lèi)對(duì)固態(tài)發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

在發(fā)酵工業(yè)中，氮源是一些產(chǎn)物代謝過(guò)程必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，氮源還是一些構(gòu)成菌體的物質(zhì)，所以在培養(yǎng)基中添加氮源是必要的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，氮源為NH4Cl 時(shí)柚苷酶酶活力最低，而(NH4)2SO4時(shí)柚苷酶酶活力最高，且?guī)缀鯙樽畹椭档膬杀?。微生物發(fā)酵中一般采用蛋白質(zhì)類(lèi)的氮源如蛋白胨等為主，但是在固態(tài)發(fā)酵中由于培養(yǎng)基中加水量少，所以蛋白胨極易和黑曲霉發(fā)生粘黏，從而導(dǎo)致黑曲霉與蛋白胨的接觸面減少，而導(dǎo)致黑曲霉發(fā)酵緩慢，柚苷酶酶活力降低。所以本實(shí)驗(yàn)條件中采用(NH4)2SO4這類(lèi)無(wú)機(jī)氮源柚苷酶酶活力最佳。

圖4 不同氮源對(duì)柚苷酶酶活力的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Orthogonal experimental design)是一種研究多因素多水平的設(shè)計(jì)方法，它是一種分式析因的設(shè)計(jì)方法。它是根據(jù)正交性從所有實(shí)驗(yàn)中挑選出“均勻分散，齊整可比”的具有代表性的點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[25]。

單個(gè)的因素能夠確定每個(gè)因素對(duì)黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響，但是不能確定各因素之間的交互作用對(duì)柚苷酶酶活力的影響，所以根據(jù)上述的四個(gè)影響黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從每個(gè)因素中選取了3個(gè)具有代表性的條件，設(shè)計(jì)了L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)因素表(表1)，探究最佳的柚苷酶發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶條件。

正交實(shí)驗(yàn)的綜合評(píng)分分析是根據(jù)各指標(biāo)的重要性不同, 按照得出的試驗(yàn)結(jié)果綜合分析。而極差是實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析的重要指標(biāo)。根據(jù)試驗(yàn)可知結(jié)果如表2所示，RA>RB>RD>RC也就是黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的因素大小順序?yàn)榻臃N量>固液比>氮源加入量>誘導(dǎo)劑與疏松劑的比例，所以，培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B2C3D2。及黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶最佳條件組合為接種量為10%(v/v)，固液比為1∶2.5，橙皮粉加入量為3.0 g，麩皮加入量為2.5 g，(NH4)2SO4的加入量為0.5 g。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳固態(tài)發(fā)酵參數(shù)A2B2C3D2，即接種量為10%(v/v)，固液比為1∶2.5，橙皮粉加入量為3.0 g，麩皮加入量為2.5 g，(NH4)2SO4的加入量為0.5 g/瓶。采用以上參數(shù)進(jìn)行黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的實(shí)驗(yàn)，得到的柚苷酶酶活力高達(dá)18 697.49 U/g，高于正交實(shí)驗(yàn)表中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此證明該條件是最優(yōu)培養(yǎng)條件。

國(guó)內(nèi)外也有一些對(duì)于產(chǎn)柚苷酶的研究。吳升山等[26]優(yōu)化了發(fā)酵溫度、菌絲形態(tài)、培養(yǎng)基初始pH、接種量和裝液量等發(fā)酵條件提高柚苷酶酶活，最大酶活力為420.68 U/mL；錢(qián)偉等[13]采用固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶，對(duì)其固態(tài)培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最大柚苷酶酶活力為1 248.0 U/g；王聳等[18]采用固態(tài)發(fā)酵棘孢曲霉產(chǎn)柚苷酶得到最大柚苷酶酶活力8.19 IU/g干物質(zhì)；NI等[27]進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的研究得到柚苷酶，其酶活力最大為2.58IU/mL；KUMAR等[28]以橙皮和葡萄柚皮為碳源對(duì)十二種絲狀真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶，得到結(jié)論為以柚子皮為底物產(chǎn)柚苷酶酶活力更高，最大酶活力為7.48 IU/mL。與上述研究相比，本實(shí)驗(yàn)研究具有更高的柚苷酶酶活力，因此本實(shí)驗(yàn)研究為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶提供了更好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 結(jié)論

以橙皮為碳源，采用固態(tài)發(fā)酵黑曲霉生產(chǎn)柚苷酶，優(yōu)化了固態(tài)基質(zhì)中接種量、固液比、誘導(dǎo)劑與疏松劑比例、氮源種類(lèi)等因素，進(jìn)一步通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到了較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)果表明不同實(shí)驗(yàn)因素對(duì)柚苷酶發(fā)酵酶活的影響程度為接菌量>固液比>氮源濃度>誘導(dǎo)劑與疏松劑比例，在250 mL三角瓶中，當(dāng)接種量為10%(v/v)，培養(yǎng)基的固液比為1∶2.5，(NH4)2SO4的量為0.5 g，誘導(dǎo)劑與疏松劑比例為3∶2.5時(shí)，柚苷酶酶活力最大，最大柚苷酶酶活力為18 697.49 U/g。此條件制備的柚苷酶酶活力相對(duì)較高，本研究為工業(yè)上固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。