李若凡， 叢麗娜， 謝定剛， 張靖軒， 何媛媛

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連116034

海洋微生物已經(jīng)成為農(nóng)用抗生素的新資源[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn) 50%以上新發(fā)現(xiàn)的海洋微生物活性物質(zhì)是由海洋放線菌產(chǎn)生的，許多放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有醫(yī)藥和植物保護方面的用途，已廣泛用作抗細菌、抗真菌和抗腫瘤藥物。海洋鏈霉菌在低溫，高鹽，高壓和寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境中生存，這樣的特殊環(huán)境使其能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)[2-5]。許多學(xué)者從海洋環(huán)境中分離得到了多種產(chǎn)生新活性物質(zhì)的海洋放線菌，并對得到菌株的發(fā)酵條件、生物活性以及活性物質(zhì)的分離鑒定進行了研究，取得了可喜的成果[6,7]。作者從大連海域的海參腸道中分離獲得一株海洋放線菌優(yōu)良菌株 HS-B34，通過對其發(fā)酵液中活性成分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，證明該菌株對多種病原菌均具有較強的抑制效果，表現(xiàn)出良好的生防應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

生產(chǎn)菌株: 海洋鏈霉菌HS-B34菌株(StreptomyceHS-B34)，由大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院叢麗娜教授的實驗室從大連海域的海參腸道中篩選得到。

供試病原菌株：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)。

1.2 培養(yǎng)基

供試病原菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

固體平板培養(yǎng)基：酵母浸粉 5 g,胰蛋白胨 10 g,氯化鈉 10 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水 1 000 mL, 調(diào)節(jié)pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：酵母浸粉 5 g,胰蛋白胨 10 g,氯化鈉 10 g,蒸餾水 1 000 mL, 調(diào)節(jié)pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(高氏一號培養(yǎng)基)：可溶性淀粉 20 g, 硝酸鉀 1 g, 硫酸亞鐵0.01 g,結(jié)晶硫酸鎂 0.5 g, 磷酸氫二鉀 0.5 g, 海水 1 000 mL, 調(diào)節(jié) pH 7.2 ～ 7.4。

優(yōu)化的鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基(本實驗室研制)：玉米淀粉25.0 g, 蛋白胨1 g, K2HPO4·3H2O 0.3 g, MgSO4·7H2O 0.3 g和CaCO30.4 g, 海水1 000 mL, 調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4。

以上培養(yǎng)基需121 ℃，20 min滅菌后使用。

1.3 儀器與試劑

分析型高效液相色譜儀，Waters 600 controller(美國 Waters 公司)；分析型色譜，YMC-Pack ODS-A(北京慧德易科技有限公司)；硅膠柱層析所用硅膠，100目～200目(青島海洋化工有限公司)；薄層層析用分析板和制備板均為GF254(安徽良臣硅源材料有限公司)；質(zhì)譜儀，LCQ-Advantage 液質(zhì)聯(lián)用(美國菲尼根質(zhì)譜公司)；高效液相色譜和ESI-MS 所用甲醇為色譜純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑為化學(xué)純或分析純。

1.4 菌株 HS-B34發(fā)酵液的制備

從-80 ℃冰箱中取出保存的海洋鏈霉菌HS-B34菌種，涂布到固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)3 d～4 d，培養(yǎng)基表面長出白色菌落。挑取其中一個菌態(tài)較好的單菌落，使用平板劃線法，接種到固體平板培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)3 d～4 d。挑取長出的白色單菌落1～2個，接種到原始種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、220r/min的搖床培養(yǎng)2 d。將該種子液按照5% (v/v)的接種量，接種到原始發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7 d。測定發(fā)酵液的抑菌活性，并離心收集發(fā)酵上清液。

1.5 抗菌活性物質(zhì)的提取及純化

以副溶血性弧菌為指示菌，采用活性追蹤的方式分離純化抗菌活性物質(zhì)。用等體積的乙酸乙酯與菌株HS-B34 發(fā)酵上清液混勻，靜置 12 h；反復(fù)萃取 2 次，合并有機相，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到干燥粗提物。采用濾紙片法測定萃取物的抑菌活性，將該活性粗體物置于-4 ℃冰箱保存。

采用硅膠柱層析對活性粗提物進行分離純化。硅膠層析柱使用濕法裝柱和濕法上樣。根據(jù)TLC的實驗結(jié)果，洗脫條件采用氯仿-甲醇體系梯度洗脫，即由氯仿∶甲醇(100∶0)開始慢慢增加至氯仿：甲醇(0∶100)。由幾次實驗的結(jié)果分析得知，活性粗提物的第一個組分在氯仿∶甲醇(99∶0.1)時就開始沿硅膠柱向下移動。因此，洗脫體系由氯仿∶甲醇(99∶0.1)先緩慢增加極性，之后快速增加極性。

由于該活性粗體物有顏色出現(xiàn)，當(dāng)展開劑為氯仿∶甲醇為99∶0.1時，就可以看到具有顏色的條帶沿著層析柱向下移動，因此從第一個有顏色的條帶移動到層析柱底時開始收集。每管收集 10 mL，采用薄層色譜法檢測每個收集管中洗脫液的組分，每種洗脫收集液經(jīng)檢測斑點逐漸消失，再改用下一個梯度洗脫液繼續(xù)進行。合并相同斑點的洗脫液，減壓濃縮后得到各個單組分樣品。再經(jīng)測定抑菌活性，獲得具有抑菌活性的單組分，分別置于-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 抗菌活性組分的純度檢測

分離純化過程中的不同組分采用薄層層析法和高效液相色譜法檢測純度。硅膠板為 GF254 型，根據(jù)組份極性不同選用不同配比的三氯甲烷-甲醇溶液為展開劑，在紫外燈254 nm 波長處顯影。

取少量已分離的組分樣品溶于甲醇中，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾，利用分析型 HPLC，以乙腈和水為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為 YMC-Pack ODS-A 分析柱(6 mm×250 mm，5 μm)，UV 檢測器，其檢測波長為 254 nm。進樣量為 20 μL，以1 mL/min 的流速洗脫柱子50 min。

1.7 抗菌活性組分的結(jié)構(gòu)鑒定

液質(zhì)聯(lián)用色譜儀工作條件：采用 MS 柱(2.6 mm×250 mm，2 μm)進行分析，檢測波長為 254 nm，流速為 0.5 mL/min；電噴霧操作電壓 4.02 kV，操作電流 0.39 μA，毛細管溫度 275 ℃，干燥氣(N2)流速為 19.92 L/min。傅里葉紅外吸收光譜分析條件：紅外檢測儀為德國布魯克光學(xué)儀器公司(Bruker Optics INc．) VERTEX 80V傅里葉變換紅外光譜儀，光譜分辨率 ≥0.06cm-1信噪比大于30 000∶1，光譜范圍(5～50 000) cm-1。

1.8 抗菌活性組分的抑菌譜測定

利用幾種在食品和飼料工業(yè)以及海水養(yǎng)殖業(yè)中常見的致病菌為指示菌，包括黃曲霉(Aspergillusflavus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocusaureus)、大腸桿菌 (Eschrichiacoli)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)，采用濾紙片法[8]，各取分離后的單組分物質(zhì)10 mL，測定該組分對不同致病菌的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HS-B34的培養(yǎng)發(fā)酵及產(chǎn)物粗提取

將本實驗室已分離和鑒定的海洋鏈霉菌HS-B34[9]，分別在高氏一號培養(yǎng)基和實驗室自行篩選的培養(yǎng)鏈霉菌的優(yōu)化培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，各取250 mL發(fā)酵液進行離心并收集上清液，經(jīng)過乙酸乙酯萃取并旋蒸得到粗提物。使用副溶血性弧菌作為指示菌，通過牛津杯法[10]測定兩種粗提物的抑菌活性，實驗結(jié)果如圖1中A和B所示。結(jié)果表明使用優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵時，抑菌圈直徑明顯大于高氏一號培養(yǎng)基。所以，后續(xù)的研究使用該優(yōu)化培養(yǎng)基進行菌株HS-B34的發(fā)酵。選擇乙酸乙酯作為菌株 HS-B34 發(fā)酵液抗菌活性物質(zhì)萃取的有機溶劑，使用濾紙片法測定其萃取物的抑菌活性，實驗結(jié)果如圖1中C所示。

2.2 利用硅膠柱層析分離活性粗提物

首先利用薄層色譜法(TLC)對菌株HS-B34發(fā)酵液提取物進行分析,以TLC分析結(jié)果為指導(dǎo)分段收集硅膠柱層析上的洗脫液，將得到的各管洗脫液分別濃縮并點樣分析，再合并同類組分，最后得到四個組分，分別記為A1，A2，A3和A4。結(jié)果如圖2所示。利用副溶血性弧菌測試各組分抑菌活性，結(jié)果表明，組分A1的對弧菌的抑菌活性最強，而組分A3和A4沒有活性(圖3)。

圖1 發(fā)酵液代謝產(chǎn)物及粗提液對副溶血性弧菌的抑菌效果

圖2 硅膠柱組薄層層析結(jié)果

2.3 組分A1的純度檢測

從400 mg的活性粗提物中經(jīng)過硅膠柱層析分離，共獲得組分A1的質(zhì)量為86 mg，組分A2為12 mg,而且A1的抗菌活性較強，因此首先選擇組分A1作為后期純化以及結(jié)構(gòu)鑒定的對象。當(dāng)化合物被鑒定時，通常要求化合物達到一定的純度。本實驗采用 HPLC 檢測組分A1純度，其含量為 94.3%，說明已達到結(jié)構(gòu)鑒定的要求(圖4)。

2.4 組分 A1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

采用質(zhì)譜方法對組分A1進行結(jié)構(gòu)鑒定。根據(jù) ESI-MS(positive)譜圖(圖 5)，[M+H]+=279，[M+Na]+=301，可知物質(zhì) A1的相對分子質(zhì)量 M=278。

圖4 組分 A1 的高效液相色譜純度檢測結(jié)果

圖5 組分A1的 ESI-MS (positive )譜圖

采用傅里葉紅外吸收光譜分析組分 A1的分子結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖6。將該圖譜分為三個波段進行分析，分別為 (400～1 200) cm-1， (1 200～1 900) cm-1以及(2 500 ～ 40 000) cm-1(表2)。

結(jié)合 ESI-MS譜圖，確定該化合物的分子式為C16H22O4，與文獻[11]的標準譜圖對比可以看到：在實測紅外光譜中， 567.24 cm-1為C-C鍵彎曲振動；705.35 cm-1和651.47 cm-1這兩個峰都為苯環(huán)的變形振動；744.62和842.50 cm-1屬于苯環(huán)的面外振動；942.00和962.94 cm-1屬于兩個取代苯環(huán)鏈上的C-O的伸縮振動，其中 942.00 cm-1為C-O 的不對稱伸縮振動，而967 cm-1C-O的對稱伸縮振動。另外，1 039.48、1 074.61 和 1 122.28 cm-1分別為苯環(huán)的面內(nèi)對稱伸縮振動、苯環(huán)變形振動和苯環(huán)的面內(nèi)搖擺振動以及靠C O雙鍵的C-O-單鍵伸縮振動。

這些特征吸收峰與各基團與鄰苯二甲酸二丁酯的特征吸收譜帶基本一致，一般 (400～1 333) cm-1為 C-X 單鍵伸縮振動以及各種彎曲振動，(650～1 000) cm-1為 Ar-H面外伸縮振動。這個區(qū)域的理論模擬值與實際測得的紅外光譜的特征吸收峰基本一致，且基團振動峰位置也符合鄰苯二甲酸二丁酯的紅外理論基團特征峰位置[11,12]，故推斷該化合物的結(jié)構(gòu)為鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)(見圖7)。

2.5 組分A1的抑菌圖譜

以幾種在食品和飼料工業(yè)以及海水養(yǎng)殖業(yè)中常見的致病菌為指示菌，采用濾紙片法，檢測所純化的

圖6 組分A1的紅外光譜譜圖

表1 紅外光譜出峰位置的解析

圖7 鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)

組分A1，即化合物鄰苯二甲酸二丁酯的抑菌圖譜(表3)?？梢钥闯?，該化合物對這些常見的致病菌都有抑菌活性，且對于副溶血性弧菌的抑菌活性最為明顯。

表2 組分A1抑菌圖譜的測定

3 結(jié)論

本文以副溶血性弧菌為指示菌，采用濾紙片法進行抗菌活性追蹤，通過乙酸乙酯萃取、硅膠吸附柱層析、制備型薄層層析和HPLC 等技術(shù)，對來自海洋的放線菌 HS-B34菌株發(fā)酵液的抗菌活性物質(zhì)進行分離純化，得到2個抗菌活性組分A1和A2。進一步對含量較高的A1組分通過液相色譜、ESI-MS和紅外光譜進行結(jié)構(gòu)鑒定，確定該組分為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。

國內(nèi)外很多學(xué)者報道植物和微生物可產(chǎn)生具有生理活性的物質(zhì)，有關(guān)從放線菌代謝產(chǎn)物中分離得到鄰苯二甲酸二丁酯及其生物活性的研究較多[12]。它是一種良好的增塑劑，主要用于聚氯乙烯的加工，使制品柔軟性良好，也是硝酸纖維素的優(yōu)良增塑劑[13]。但本研究檢測了從海洋鏈霉菌中分離到的DBP，它對多種在食品工業(yè)和海水養(yǎng)殖業(yè)中常見的病原菌具有廣譜的抗菌活性，尤其對副溶血性弧菌具有顯著的抑制作用。這個研究現(xiàn)象目前尚未見報道，有待于深入研究它對弧菌的作用機理以及在養(yǎng)殖過程中的開發(fā)利用。