孟 鵬, 劉曉鳳, 衣振偉, 謝 凡, 王光強(qiáng), 熊智強(qiáng), 張 匯, 宋 馨, 艾連中, 夏永軍

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

膳食纖維(Dietary fiber)是一類在人體腸道內(nèi)難以被酶解消化的碳水化合物及其類似物的總稱，被譽為第七營養(yǎng)素，其主要化學(xué)成分為半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、樹脂、果膠及木質(zhì)素[1]。大量研究表明，DF在防治血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、 泌尿系統(tǒng)的疾病及維持正常的血糖水平、體重控制等方面具有重要作用[2]。大多數(shù)的膳食纖維對脂肪、膽固醇、膽酸 鈉等都有一定的吸附作用[3],按其溶解性可分為水不溶性膳食纖維(IDF)和水溶性膳食纖維(SDF)，其中不溶性膳食纖維具有促進(jìn)腸道蠕動，降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)血壓以及預(yù)防腸胃疾病和心血管疾病等生理功能[4]，對人體健康起著積極的作用，是一種比較理想的功能性食品原料。

牛樟芝(Antrodiacamphorata)，又名樟芝、樟菇、牛樟菇，屬于真菌界，由于其豐富的生物活性，被美譽為“靈芝之王”、“森林中的紅寶石”等[5]。目前已從牛樟芝中分離得到的化學(xué)成分超過三百種，其中三萜類物質(zhì)、腺苷、樟芝多糖為其主要活性成分[6]。大量文獻(xiàn)研究表明，牛樟芝具有保肝、降血壓、降膽固醇、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生物活性[7,8]可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，食品,日化領(lǐng)域。目前大多數(shù)研究主要集中在水溶性多糖發(fā)酵、提取以及功能評價方面[9]。工業(yè)生產(chǎn)過程中，牛樟芝子實體或是菌絲體在經(jīng)過乙醇、水提取之后，主要提取其醇溶性化合物和水溶性多糖，但是殘渣中含有大量水不溶性膳食纖維未被充分利用。本實驗主要對牛樟芝椴木栽培和皿式培養(yǎng)兩種牛樟芝培養(yǎng)物殘渣中IDF的化學(xué)組成、初步結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)(持水性、持油性、膨脹力、膽固醇和膽酸鈉吸附性)等方面進(jìn)行分析和研究，為提高牛樟芝不溶性膳食纖維的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與試劑

牛樟芝椴木栽培和皿式培養(yǎng)原料是經(jīng)過乙醇和熱水浸提過后的，由睿森生物科技有限公司贈送；乙酸、NaOH、二甲基亞砜(DMSO)，無水氯化鋰(LiCl、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖、膽固醇、脫氧膽酸鈉、鄰苯二甲醛、糠醛，乙酸、NaOH、濃硫酸、單糖標(biāo)準(zhǔn)品為生化分析試劑，購買與國藥集團(tuán)。

1.2 實驗儀器

電熱恒溫水浴鍋(HWS26)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000A)，循環(huán)水真空泵(SHZ-III)立式離心機(jī)(LXJ-IIB)，電子天平(ML104/02)，超純水系統(tǒng)(Q-POD)，pH計(PHS-3C)，紫外分光光度計(UV2600),離子色譜儀(Dionex ICS-3000)，高效液相(HPLC ODS-2), 凍干燥機(jī)(FD-1)，X射線衍射儀(MiniFlex600)，傅里葉變換紅外光譜儀(IRAfinity-1S)壓片機(jī)(DF-4B)，掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800)。

1.3 實驗方法

1.3.1牛樟芝殘渣IDF的制備

將牛樟芝殘渣經(jīng)過干燥、超微粉碎后備用，以0.5 mol/L NaOH和0.01 M NaBH4溶液對超微粉碎后的牛樟芝殘渣粉末浸提兩次，浸提溫度4 ℃，浸提時間12 h，料液比為1∶10(m/v)，合并浸提液加入適量冰醋酸進(jìn)行中和，靜置2 h后離心收集沉淀；將沉淀用超純水洗滌三次后用0.25 M LiCl-DMSO溶液進(jìn)行溶解，將不溶于LiCl-DMSO溶液的沉淀物透析3 d，冷凍干燥后即為牛樟芝IDF，將從椴木栽培子實體和皿式培養(yǎng)菌絲體提取出的IDF分別命名為ACA-NK和ACA-NF。

1.3.2牛樟芝殘渣IDF中膳食纖維含量、單糖組成的測定

根據(jù)GB 5009.88-2014測定其牛樟芝殘渣IDF含量。采用離子色譜儀(Dionex ICS-3000)測定牛樟芝IDF的單糖組成[10]。具體方法如下:將100 μL 5 mg/mL的多糖樣品放入水解管中，加入4 mol/L的三氟乙酸于水解管中。將試管抽真空，110 ℃水解2 h，然后用氮氣在65 ℃的水浴中干燥。然后加入1 mL的超純水清洗、吹干。加水溶解后，用0.45 μL微孔膜過濾，然后用超純水調(diào)至25 mL。色譜條件：流動相為 10 mmol/L NaOH,流速為 0.9 mL/min，柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量為 20 μL通過比較標(biāo)準(zhǔn)單糖和樣品的保留時間，測定樣品中的單糖種類。根據(jù)峰積計算單糖的百分比。

1.3.3牛樟芝水不溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)表征

(1) 掃描電子顯微鏡觀察(SEM)

利用掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800)對牛樟芝IDF樣品表面微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察[11]。將冷凍干燥后的樣品固定在雙面導(dǎo)電透明膠帶上，并涂以10 nm金層。隨后。掃描圖像是在加速電壓為25 kv，放大倍數(shù)為500的情況下拍攝的。

(2) 傅立葉紅外光譜分析(FT-IR)

將樣品置于烘箱中烘干至恒重后，以1∶100(w/w)比例與溴化鉀(KBr)混合，研磨均勻后進(jìn)行壓片處理[11]，采用傅立葉紅外光譜儀(IRAfinity-1S)進(jìn)行分析，掃描波長為4 000 cm-1～500 cm-1。

(3) X-射線衍射掃描(XRD)

采用X射線衍射儀(MiniFlex600)觀察三種膳食纖維的晶區(qū)[12]。采用Cu-K α輻射源(λ=1.542)，運行電壓為40 kv，電流為40 mA，衍射強(qiáng)度掃描范圍為4°到70°，角度步長為0.02°。樣品的結(jié)晶度由MDI Jade 6.5軟件從曲線下的峰面積計算，公式如下:

(1)

其中，I002表示X-射線圖譜中結(jié)晶區(qū)的面積，I001表示X-射線圖譜中無定型區(qū)的面積。

1.3.4牛樟芝IDF樣品吸附特性研究

(1) 持水力的測定[13]

將離心管(50 mL)進(jìn)行干燥至恒重，然后準(zhǔn)確稱取各膳食纖維樣品0.5 g(m0)于離心管中，進(jìn)行稱量，此為m1(管重+樣品重)，然后再加入10 mL蒸餾水，充分搖勻，室溫下浸泡2 h，然后15 000r/min離心15 min，小心棄去上清液再進(jìn)行稱量，此為m2。按以下公式進(jìn)行計算：

(2)

(2) 持油力的測定[13]

將離心管(50 mL)進(jìn)行干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取各膳食纖維樣品0.5 g(M0)于離心管中，進(jìn)行稱量，此為M1(管重+樣品重)，然后再加入大豆油10 mL，分別在25 ℃和37 ℃條件下靜置1 h，然后在8 000 r/min條件下離心20 min，小心棄去上層油，可以用濾紙小心擦拭吸干游離的油，進(jìn)行稱量，此為M2。按以下公式計算：

(3)

(3) 膨脹力的測定[13]

準(zhǔn)確稱取各膳食纖維樣品0.5 g(M0)置于25 mL量筒中，再加入20 mL的蒸餾水，混勻，靜置幾分鐘后記錄此時膨脹前的體積V1，然后在室溫下靜置24 h，記錄膨脹后的體積V2。按以下公式計算：

(4)

(4) 吸附膽固醇能力測定[14，15]

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:吸取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)工作液0. 0 mL、0. 1 mL、0. 2 mL、0. 3 mL和0. 4 mL分別置于10 mL試管中，在各管內(nèi)加入醋酸使總體積達(dá)0.4 mL。分別依次 加入0.2 mL鄰苯二甲醛試劑、0.01 mL蒸餾水，沿管壁加入4.0 mL混合酸，混勻，10 min后在550 nm波長下測定吸光度。以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

膳食纖維對膽固醇吸附能力的測定:稱取2個新鮮蛋黃，加入其9倍質(zhì)量的蒸餾水，充分?jǐn)嚢璧玫包S稀釋液。分別稱取兩種IDF樣品1.0 g于250 mL錐形瓶中，分別加入50 mL蛋黃稀釋液，調(diào)節(jié)體系為2.0和7.0。置于恒溫水浴振蕩器中，37 ℃的條件下振蕩2 h。離心混合液，吸取上清液0.5 mL，試驗步驟同標(biāo)準(zhǔn)溶液測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得上清液中膽固醇的含量，計算膳食纖維對膽固醇吸附率。根據(jù)以下公式計算：

(5)

其中，C0為稱取的樣品質(zhì)量/g；C1為吸附前蛋黃液中膽固醇含量/mg；C2為吸附后上清液中的膽固醇含量/mg。

(5) 吸附膽酸鹽能力測定[14，15]

膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液(1.0 mg/mL)，取糠醛試劑0.3%，45%硫酸振蕩混勻，然后將各管置65 ℃水浴30 min，自然冷卻至室溫，在620 nm波長下進(jìn)行比色，記錄結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得膽酸鈉濃度(X，mg/mL)與吸光度(Y)之間的直線方程。

樣品對膽酸鈉吸附量的測定：取4個250 mL的錐形瓶，分別加入含0.2 g膽酸鈉的0.15 mol/L的NaCl溶液100 mL，分別稱取4種膳食纖維樣品各0.125 g，加入到錐形瓶中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后用PBS溶液調(diào)節(jié)體系pH為7.0。把錐形瓶放于37 ℃搖床中振搖2 h，然后于8 000 r/min條件下離心20 min，準(zhǔn)確吸取1 mL上清液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定其吸光值。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的線性方程，來計算上清液中剩余膽酸鈉的量，結(jié)果計算公式：

(6)

其中，S1為吸附前溶液中膽酸鈉含量/mg，S2為吸附后上清液中剩余的膽酸鈉含量/mg，S0為稱取的樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上所有測定項目每個重復(fù)測試3次，試驗數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛樟芝殘渣IDF含量與單糖組成

2.1.1牛樟芝殘渣IDF含量測定

通過GB 5009.88—2014方法測定ACA-NK和ACA-NF的膳食纖維含量分別為87.0%和85.3%，高于之前報道過的谷類及水果副產(chǎn)品[16，17](蘋果0.2%、米糠61.7%) 的含量，也表明提取到的膳食纖維的純度較高可作為高膳食纖維功能性食品原料的來源。

2.1.2牛樟芝殘渣IDF單糖組成分析

單糖標(biāo)準(zhǔn)品和牛樟芝殘渣中兩種IDF的離子色譜如圖1所示，通過標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜和牛樟芝殘渣IDF的圖譜各個單糖出峰的保留時間比較可知，ACA-NK和ACA-NF兩種IDF單糖組成的種類相同，都是由巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和果糖這六種單糖組成。其中，葡萄糖、木糖和甘露糖是其主要組成成分，達(dá)到了94.02%。

(a)標(biāo)準(zhǔn)曲線單糖、氨基葡萄糖和氨基半乳糖;(b)ACA-NK的單糖組成;(c)ACA-NF的單糖組成圖1 ACA-NK和ACA-NF的單糖組成和分子量

2.2 牛樟芝殘渣IDF的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1SEM分析

通過SEM觀察牛樟芝殘渣IDF的表觀結(jié)構(gòu)，如圖2所示。ACA-NK和ACA-NF表觀構(gòu)象相似。ACA-NK和 ACA-NF表面幾乎沒有球狀淀粉或蛋白顆粒。兩種不溶性膳食纖維表現(xiàn)為不規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有斷裂的痕跡。可能是堿液提取過程導(dǎo)致纖維基質(zhì)表面的破壞和纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的暴露。這些松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與它們的物理化學(xué)性質(zhì)有很大的關(guān)系，如促進(jìn)水分子的吸附和保留，從而增加持水和持油能力。然而，在低倍放大時可以發(fā)現(xiàn)一些不規(guī)則的塊狀小結(jié)構(gòu)，在高倍放大時表面并不光滑，這些結(jié)果也證實了牛樟殘渣IDF 較為疏松，具有良好吸附性能。

2.2.2FT-IR分析

由圖3可知，樣品在3 434.40 cm-1處的吸收峰是由一些游離的OH基團(tuán)與氫鍵締合形成的伸縮振動峰，為纖維素所具有的特征吸收峰；2 929.85 cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，可推測此處有C—H基團(tuán)[18]；1 642.72 cm-1處是由C—O基團(tuán)伸縮振動引起的說明樣品中可能含有聚木糖[19]；1 642.72 cm-1和1 637.41 cm-1處的吸收可能是糖分子中C=O峰基團(tuán)的伸縮振動所產(chǎn)生,樣品中可能含有木質(zhì)素[19]。1 149.59 cm-1和1 127.31 cm-1處吸收峰是由纖維素及半纖維素中的C—O—C 基團(tuán)的伸縮振動而產(chǎn)生的[20]；1 033.78 cm-1和1 033.21 cm-1處是半纖維素、纖維素及木質(zhì)素中C=O基團(tuán)的伸縮振動[20]。

圖3 牛樟芝殘渣不溶性膳食纖維的傅里葉變換紅外光譜圖

2.2.3XRD分析

由圖4可知， 在掃描角度2θ為 17.7° 和 20.9° 處有強(qiáng)衍射峰，掃描角度27.70°和34.09° 處有弱衍射峰。由非線性多峰擬合函數(shù)被用于評估樣品的結(jié)晶度指數(shù)[21]。結(jié)果表明牛樟芝殘渣兩種IDF結(jié)晶度沒有顯著性差異，其結(jié)晶度分為31.64%和30.92%，結(jié)晶度較低的原因可能是因為堿溶液破壞了纖維素的結(jié)構(gòu)，使其結(jié)晶區(qū)部分轉(zhuǎn)化為無定型區(qū)。

圖4 牛樟芝不溶性膳食纖維的X射線衍射圖譜

2.3 牛樟芝殘渣IDF 持水力、持油力、膨脹力的比較

膳食纖維的水合作用主要取決于其表面親水基團(tuán)和結(jié)構(gòu)中的松散空腔，因而表現(xiàn)出良好的持水力[22]。ACA-NK與ACA-NF的膨脹力見圖5a,從圖中可以看出，ACA-NK和ACA-NF的膨脹力都比較小，分別是(0.05±0.02) mL/g，(0.06±0.11) mL/g。持水力和持油力如圖5b所示，ACA-NK和ACA-NF的持水力分別是(7.43±0.16) g/g、(6.09±0.12) g/g，且ACA-NK略高于ACA-NF,兩者與江籬藻中IDF(6.64 g/g)比較接近，是黑糯米米糠中IDF(3.04±0.10) g/g的兩倍左右[23,24]。持油力主要表現(xiàn)在膳食纖維對油脂的吸附能力，IDF對油脂一般具有良好的吸附作用，從而減少了人體腸道對脂肪的吸收，起到了一定的減肥功效[25]。從圖5b可以看出兩者持油能力相當(dāng)，分別為(3.90±0.21) g/g、(3.81±0.17) g/g,表現(xiàn)出較高的持油能力。牛樟芝殘渣IDF具有良好的理化性質(zhì)，能夠在人體內(nèi)發(fā)揮更好的功能特性，適合加工成功能性食品。

(a)膨脹力;(b)持水力和持油力；(*)(P<0.05表示差異顯著， (**)P<0.01表示差異極顯著。圖5 牛樟芝殘渣不溶性膳食纖維ACA-NK和 ACA-NF的膨脹力、持水力、持油力比較

2.4 牛樟芝殘渣IDF對膽固醇和膽酸鈉的吸附作用

膳食纖維可減少血清膽固醇的含量，從而降低了發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險。由于膳食纖維對膽固醇的吸附能力受pH影響較大，故本實驗設(shè)置了pH=2和pH=7兩個值，是分別模擬胃環(huán)境和腸道環(huán)境[26]。如圖6a所示，發(fā)現(xiàn)ACA-NK和ACA-NF在中性環(huán)境下(pH=7)對膽固醇吸附量均顯著高于其在酸性環(huán)境中(pH=2)的吸附量，這表明膳食纖維在腸道環(huán)境中膽固醇的能力更強(qiáng)。另外ACA-NF的吸附量20.19 mg/g要高于ACA-NK 17.81 mg/g這可能是因兩者的結(jié)構(gòu)和比表面積的差異引起的。但整體來說兩種牛樟芝IDF對膽固醇都有良好的吸附作用。膳食纖維通過吸附膽汁酸抑制腸道對膽汁酸的吸收作用，降低了肝中膽汁酸的量，從而加速分解了體內(nèi)的膽固醇，有效降低人體血清和肝中膽固醇的含量。此外，通過膳食纖維的吸附作用降低了腸道內(nèi)膽汁酸濃度，可預(yù)防體內(nèi)膽結(jié)石形成[27]。從圖6b可知，ACA-NK和ACA-NF對膽酸鈉的吸附能力分別為44.91 mg/g和36.57 mg/g，與黑糯米、小麥以及大豆中的IDF(6.45 mg/g～34.56 mg/g)相比均表現(xiàn)出較高水平的吸附能力[24,28]。根據(jù)之前的報道膽酸鈉濃度對膳食纖維的吸附作用有較大的影響，在一定膽酸鈉濃度范圍內(nèi)，膳食纖維對膽酸鈉的吸附能力隨著膽酸鈉濃度的增大而增加[28]。而本實驗選用了較低濃度的膽酸鈉溶液(2 mg/mL)牛樟芝殘渣IDF卻表現(xiàn)出了較高的吸附能力，證明了牛樟芝殘渣IDF對膽酸鈉有較為理想的吸附性能。

(a)對膽固醇的吸附；(b)對膽酸鈉的吸附；(*)(P<0.05 表示差異顯著，(**)P<0.01表示差異極顯著。圖6 牛樟芝殘渣不溶性膳食纖維ACA-NK和 ACA-NF對膽固醇、膽酸鈉吸附能力比較

3 結(jié)論

試驗采用堿液低溫和DMSO系統(tǒng)純化方法提取制備牛樟芝殘渣IDF。牛樟芝IDF持水力、持油力等理化性質(zhì)良好，其對對脂肪、膽固醇和膽酸鹽均有一定的吸附作用，尤其對膽固醇和膽酸鈉表現(xiàn)出了優(yōu)于一般膳食纖維的的吸附性能，具備開發(fā)功能性食品的潛力。通過對牛樟芝殘渣IDF結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征可知，膳食纖維純度較高，含有六種單糖，主要是由葡萄糖、木糖、甘露糖組成。紅外光譜表征出現(xiàn)較少的雜峰，且具有明顯纖維結(jié)構(gòu)特征，含有大量氫鍵，通過掃描電鏡看出，總體纖維結(jié)構(gòu)呈疏松狀且纖維素有一定的螺旋與其具有良好的吸附能力有關(guān)。結(jié)果顯示，牛樟芝椴木栽培子實體和皿培菌體兩種樣品中的水不溶性膳食纖維結(jié)構(gòu)相似，在吸附性方面有一定差異。本試驗從牛樟芝殘渣中制備的IDF能具有減少機(jī)體對膳食中脂肪和膽固醇的攝入的潛力，可以作為預(yù)防肥胖、高血脂等方面疾病的保健食品原料來源。