李田田，劉 芳，王淑瓊，付成冰

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

藏醫(yī)藥經(jīng)典著作《晶珠本草》記載沙棘“化血并治培根病”[1]，廣泛應(yīng)用于高原紅細(xì)胞增多癥(High Altitude Polycythemia，HAPC)的防治?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)沙棘具有抗氧化、清除ROS、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[2]。由于沙棘的化學(xué)成分復(fù)雜，其功能多樣致作用機(jī)制不明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠通過構(gòu)建、分析藥物成分-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，系統(tǒng)地闡釋藥物治療疾病的作用機(jī)制，非常適合研究此類傳統(tǒng)藥物[3]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路方法，篩選沙棘防治HAPC的有效成分，系統(tǒng)地分析其防治HAPC的靶點(diǎn)及通路，為闡明沙棘防治HAPC的作用機(jī)制提供參考。

1.數(shù)據(jù)庫與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//www.tcmspw.com)；PharmMapper服務(wù)器(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；UniProt 數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)；DrugBank 數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca/)；David 6.8軟件(http：//david.ncifcrf.gov)；KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.Genome.jp/kegg)；String數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org) 。

1.2 方法

1.2.1 沙棘成分的篩選

進(jìn)入TCMSP數(shù)據(jù)庫，在搜索欄輸入“沙棘”，設(shè)置參數(shù)DL(藥物相似度)≥30%、OB(口服生物利用度)≥0.18篩選獲取“沙棘活性成分”的文獻(xiàn)資料。

1.2.2 沙棘藥物成分靶點(diǎn)的選取

將篩選得到的沙棘化合物以mol2.格式導(dǎo)入PharmMapper服務(wù)器進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，參數(shù)設(shè)置如下：

Generate Conformers：Yes；Maximum Generated Conformations：100；Select Target Set：Human Protein Target Only；Number of Reserved Matched Targets：100。獲得靶點(diǎn)后，利用UniProt數(shù)據(jù)庫將不規(guī)范的靶點(diǎn)名稱規(guī)范化，獲取與沙棘成分相關(guān)的靶點(diǎn)及其基因信息。

1.2.3 HAPC靶點(diǎn)的選取

選擇與HAPC發(fā)病機(jī)理相關(guān)的關(guān)鍵詞輸入數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，去掉重復(fù)項(xiàng)后獲得HAPC靶點(diǎn)。

1.2.4 沙棘防治HAPC作用靶點(diǎn)的獲取

將得到的沙棘活性成分的預(yù)測靶點(diǎn)與HAPC靶點(diǎn)相對比，找到的共有靶點(diǎn)即為沙棘防治HAPC的作用靶點(diǎn)。

1.2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)靶點(diǎn)的構(gòu)建

將沙棘防治HAPC的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，參數(shù)設(shè)置如下：

蛋白種類參數(shù)：Homo sapiens，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，得出靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6 基因本體(GO)富集與KEGG通路的分析

將沙棘防治HAPC的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8軟件，進(jìn)行GO富集、KEGG通路分析，并篩選出沙棘防治HAPC的相關(guān)通路。

1.2.7 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選所得的沙棘活性成分、作用靶點(diǎn)、通路及相互作用關(guān)系的文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2.結(jié)果

2.1 化合物篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

在TCMSPW數(shù)據(jù)庫中搜索關(guān)鍵詞“沙棘”，獲得223個有關(guān)文獻(xiàn)，篩選(DL≥30%、OB≥0.18)后共得33個(表1)。將此33個有關(guān)文獻(xiàn)導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫，共預(yù)測得到262個作用靶點(diǎn)。在DrugBank數(shù)據(jù)庫中搜索與HAPC發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵詞，將搜索關(guān)鍵詞得到的HAPC靶點(diǎn)與預(yù)測所得262個作用靶點(diǎn)對比，篩掉重復(fù)項(xiàng)后共有24個靶點(diǎn)與沙棘防治HAPC有關(guān)(表2)。在這24個靶點(diǎn)中，PPARG、PPARD、MIF 、MAOB、ADH5、PDK2、RXRA等與氧化反應(yīng)有關(guān)；MAPKAPK2、PPP5C、MAPK14、MAPK10、AKT1、MAPK8、GSK3B、RHOA、MMP2等與免疫、炎癥有關(guān)；MAPK14、PPP5C、RXRA、GSK3B、MAPK10、ANG、DAPK1、MAPK8、CYP2C8、RHOA、MAPKAPK2、PRKACA、RORA、PDK2、PRKACA、LTF、ANG、AKR1C3、 AKT1等與細(xì)胞生存和凋亡有關(guān)。

表1 沙棘的活性成分

續(xù)表：

表2 沙棘防治HAPC的相關(guān)靶點(diǎn)

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更好地了解沙棘防治HAPC的作用機(jī)制，利用STRING軟件繪制沙棘防治HAPC的相關(guān)靶點(diǎn)PPI圖(圖1)，該圖共包括24蛋白節(jié)點(diǎn)、39條相互作用關(guān)系連線，其中4個蛋白節(jié)點(diǎn)無相互作用關(guān)系。

圖1 沙棘防治HAPC的靶點(diǎn)PPI圖

2.3 基因本體(GO)富集分析及KEGG通路分析

將本研究得到的24個作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8軟件進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路分析。通過GO富集分析探討沙棘預(yù)測靶點(diǎn)的功能分布，篩選(P<0.05)后分別取前十項(xiàng)繪制“生物過程”“細(xì)胞組分”“分子功能”結(jié)果圖(圖2～4)。通過KEGG分析、預(yù)測沙棘治療HAPC的相關(guān)通路，共得53條信號通路。篩選(P<0.05)得到49條信號通路，其中有21條信號通路與HAPC防治相關(guān)(表3)。這21條信號通路中與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的通路有9條；與免疫、炎癥相關(guān)的通路有11條；與血小板功能相關(guān)的通路有2條；與氧化反應(yīng)相關(guān)的通路有2條(表4)。由此可見，沙棘防治HAPC與細(xì)胞增殖凋亡、免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多種機(jī)制相關(guān)。

圖2 預(yù)測靶點(diǎn)的GO富集分析“生物過程”圖

圖3 預(yù)測靶點(diǎn)的GO富集分析“分子功能”圖

圖4 預(yù)測靶點(diǎn)的GO富集分析“細(xì)胞組分”圖

表3 沙棘防治HAPC的KEGG通路

續(xù)表：

表4 沙棘防治HAPC的KEGG通路分類

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建沙棘防治HAPC的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。

圖5 沙棘防治HAPC的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)依據(jù)系統(tǒng)生物學(xué)原理對疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行闡述，并為理解藥物與機(jī)體的相互作用提供整體性見解[4]。它的主要功用在于預(yù)測藥物有效成分、作用靶點(diǎn)、通路，利用生物信息學(xué)對藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，建立預(yù)測模型用于藥物治療疾病的機(jī)制研究[5]。

HAPC是因高原低氧環(huán)境引起的一種慢性高原病。由于高原地區(qū)缺氧，機(jī)體為了維持體內(nèi)各組織器官供氧而代償性增生紅細(xì)胞。然而紅細(xì)胞的過度增生可引起血液粘滯、微循環(huán)阻力增加，進(jìn)而加重組織缺氧[6-7]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對HAPC的治療采取改善缺氧、抗栓、抗凝等；傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)如藏醫(yī)在防治HAPC方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，主張以健胃益氣與活血化瘀法聯(lián)合治療HAPC，藏藥沙棘以其良好的活血化瘀功效被廣泛用于HAPC的治療當(dāng)中[8]。綜合本研究結(jié)果分析，沙棘防治HAPC的主要機(jī)制在于：作用于VEGF signaling pathway、Ras signaling pathway、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection、ErbB signaling pathway、Focal adhesion等通路參與體內(nèi)細(xì)胞的增殖分化、內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，并維持組織和細(xì)胞的穩(wěn)定；通過調(diào)控Fc epsilon RI signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、TNF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway等炎癥、免疫相關(guān)通路參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生及分泌，上調(diào)免疫細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力； 通過Leukocyte transendothelial migration通路抑制NADPH氧化酶的激活，減少ROS的生成，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[9]。通過PPAR signaling pathway、cAMP signaling pathway、FoxO signaling pathway 等通路參與調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)以及細(xì)胞間信息交流，參與抗氧化應(yīng)激并與其他信號通路相聯(lián)系。其中，MAPK通路在多種細(xì)胞信號通路中具有關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞增殖分化、凋亡以及細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)等多種病理生理過程[10]?？梢?，沙棘防治HAPC是通過廣泛參與細(xì)胞過程中的多條代謝通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡，改善機(jī)體炎癥反應(yīng)，減少活性氧的生成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗應(yīng)激能力。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，獲得沙棘活性成分，預(yù)測、分析其防治HAPC的靶點(diǎn)，構(gòu)建靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)、靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析，初步揭示了沙棘在防治HAPC方面的作用機(jī)制。