李占強(qiáng)，李潤樂，蘇姍姍，蘆殿香，湯 鋒*，樊海寧

[1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，高原醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室， 青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室(青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點實驗室)，青海 西寧 810001； 2.西寧海關(guān)技術(shù)中心，青海省食品安全研究重點實驗室，青海 西寧 810003； 3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海省包蟲病重點實驗室，青海 西寧 810001]

本研究以藏菖蒲AcoruscalamusL.揮發(fā)油為研究對象，明確其對體外多房棘球蚴的殺傷活性。

1.材料、儀器與方法

1.1 材料、儀器

藏菖蒲飲片(AcoruscalamusL.，購自青海中藏藥材市場)，阿苯達(dá)唑(TCI，純度>98%)。胎牛血清(BI公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)。激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss Jena公司，LSM 800)，光學(xué)顯微鏡(Carl Zeiss Jena公司，Axio Vert.A1)，培養(yǎng)箱(Thermo公司，BB15)。

1.2 方法

1.2.1 藥物提取

稱取50 g藏菖蒲飲片剪碎置500 mL燒瓶中，加水浸泡(過夜)后，采用水蒸氣蒸餾法蒸餾6 h，收集無色揮發(fā)油2.6 mL。經(jīng)無水Na2SO4干燥后的揮發(fā)油用DMEM培養(yǎng)基分別配制10.00、1.25 mg/mL濃度的藏菖蒲揮發(fā)油溶液。

1.2.2 原頭蚴的分離及體外培養(yǎng)

原頭蚴的分離及體外培養(yǎng)參考文獻(xiàn)方法[1]。

1.2.3 揮發(fā)油體外活性的檢測

在激光共聚焦培養(yǎng)皿中，依次加入1 000個原頭蚴、2 mL待測揮發(fā)油溶液(10mg/mL)后置活細(xì)胞工作站(37℃，5%CO2)進(jìn)行培養(yǎng)，并動態(tài)觀察原頭蚴存活情況。

在六孔板中，分別取2 mL待測揮發(fā)油溶液(1.25mg/mL)、對照藥物阿苯達(dá)唑溶液(10mg/mL)和PBS溶液與原頭蚴(1000個)在培養(yǎng)箱中一塊培養(yǎng)。培養(yǎng)5 h后，加入等體積伊紅溶液混合染色，吸取10 μL混合液，于光學(xué)顯微鏡下計數(shù)原頭蚴總個數(shù)和死亡個數(shù)(蟲體紅色且無活動性視為死亡[1])。

1.2.4 揮發(fā)油對原頭蚴形態(tài)的影響

將經(jīng)揮發(fā)油(10mg/mL)處理的原頭蚴用3%戊二醛固定15 h后，用PBS溶液清洗3次，再用1%鋨酸固定1 h后通過掃描電鏡觀察原頭蚴整體形態(tài)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 藏菖蒲揮發(fā)油對多房棘球蚴活力的影響

將原頭蚴放入藏菖蒲揮發(fā)油稀釋液(10mg/mL)共培養(yǎng)并實時觀察發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)起始階段，原頭蚴均處于活躍狀態(tài)，頭節(jié)外翻，整體形態(tài)完整、清晰，隨著共培養(yǎng)時間的增加，原頭蚴運動開始減緩，活力下降，15 min后，部分原頭蚴整體形態(tài)發(fā)生顯著變化，趨向于球體形態(tài)且主要特征模糊，運動性也開始減弱并消失，透光性降低(圖1箭頭所示)?？瞻讓φ战M中的原頭蚴均處于活躍狀態(tài)，頭節(jié)均外翻，原頭蚴整體形態(tài)完整、清晰。藥物作用前與作用15 min后情況如圖1所示。

ACE：藏菖蒲揮發(fā)油(10mg/mL)；PBS：對照品

2.2 藏菖蒲揮發(fā)油對多房棘球蚴的體外殺傷活性

將PBS溶液(空白對照組)、藏菖蒲揮發(fā)油(1.25mg/mL)、阿苯達(dá)唑(10mg/mL)與原頭蚴共培養(yǎng)5 h后，經(jīng)伊紅染色后在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：空白對照組中的原頭蚴沒有被伊紅染色，有一定活動性，如圖2A所示；1.25 mg/mL藏菖蒲揮發(fā)油組中的原頭蚴大部分被伊紅染色，運動性消失，如圖2B所示；10 mg /mL阿苯達(dá)唑組中的原頭蚴未被伊紅染色，具有一定活動性，如圖2C所示。鏡下統(tǒng)計原頭蚴總個數(shù)和死亡個數(shù)：空白對照組、藏菖蒲揮發(fā)油(1.25mg/mL)組、阿苯達(dá)唑(10mg/mL)組死亡率分別為(1.8±0.6)%、(94.1±2.1)%、(10.9±2.4)%。揮發(fā)油組同空白組和阿苯達(dá)唑組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖2所示。

A：PBS緩沖液；B：藏菖蒲揮發(fā)油(1.25mg/mL)；C：阿苯達(dá)唑(10mg/mL)；★：P<0.05

2.3 藏菖蒲揮發(fā)油對原頭蚴形態(tài)的影響

多房棘球蚴經(jīng)藏菖蒲揮發(fā)油(10mg/mL)作用后的掃描電鏡顯示，正常對照組原頭蚴形態(tài)飽滿，光滑完整，體表微絨毛豐富，如圖3A所示。經(jīng)藏菖蒲揮發(fā)油作用后，形態(tài)變化顯著：原頭蚴整體形態(tài)皺縮，體表凹凸不平，體表微絨毛消失，頭部鉤脫落，如圖3B所示。

A：PBS緩沖液；B：藏菖蒲揮發(fā)油(10mg/mL)

3.討論

本研究結(jié)果表明，藏菖蒲揮發(fā)油對多房棘球蚴具有較強(qiáng)的殺傷活性。

在高濃度藏菖蒲揮發(fā)油(10mg/mL)作用下，短時間內(nèi)可造成原頭蚴活力下降，在低濃度(1.25mg/mL)條件下經(jīng)長時間作用可引起較強(qiáng)的致死作用，致死率遠(yuǎn)高于10 mg/mL的阿苯達(dá)唑藥物[2]。但藏菖蒲揮發(fā)油的體內(nèi)活性有待考察。

藏菖蒲揮發(fā)油對原頭蚴形態(tài)的影響同烈香杜鵑揮發(fā)油相比，二者都可造成原頭蚴體表微絨毛消失、體表凹凸不平、頭部鉤脫落等，但藏菖蒲揮發(fā)油還可造成原頭蚴整體形態(tài)皺縮，有別于烈香杜鵑揮發(fā)油，提示其作用機(jī)制不一致，主要原因在于二者化學(xué)成分不同[1]。

藏菖蒲化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油(單萜、倍半萜、苯丙素)、三萜、木脂素、黃酮等。目前，已在藏菖蒲揮發(fā)油中鑒定出了近百種化學(xué)成分，包括萜類、芳香類物質(zhì)等。而芳香類物質(zhì)主要為細(xì)辛醚類成分，包括α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚和γ-細(xì)辛醚，其含量因植物變種類型及產(chǎn)地不同而差異懸殊，如在A.calamusvar.angustata中，β-細(xì)辛醚含量占80%，而在A.calamusvar.americanus中未發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚[3]。

課題組對所用的AcoruscalamusL.揮發(fā)油進(jìn)行了GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)主要成分為α-細(xì)辛醚和異丁香酚甲醚，相對含量分別為43.49%、18.43%，占總揮發(fā)油的61.92%，而β-細(xì)辛醚相對含量較低。此外，還有甲基丁香酚、異甲基丁香酚、γ-細(xì)辛醚等芳香類物質(zhì)。鄭佳等人對α-細(xì)辛醚與β-細(xì)辛醚體外殺傷多房棘球蚴的活性研究顯示，β-細(xì)辛醚對多房棘球蚴具有明顯殺傷作用，而α-細(xì)辛醚在5 mg/mL濃度下未表現(xiàn)出殺傷作用[4]。此外，有研究表明，α-細(xì)辛醚具有致肝細(xì)胞癌和致突變等毒性作用[3，5，6]。由此推斷，藏菖蒲揮發(fā)油對多房棘球蚴的體外殺傷活性物質(zhì)并不是其主成分—α-細(xì)辛醚，綜合之前相關(guān)報道，對多房棘球蚴具有顯著的殺傷作用的丁香酚、β-細(xì)辛醚都具有“C6-C3”的母核結(jié)構(gòu)，主要區(qū)別在于丙烯基中雙鍵的位置及構(gòu)型、甲氧基和羥基的取代數(shù)量和位置，文獻(xiàn)中已明確丙烯基中的1-2位為雙鍵時，順式結(jié)構(gòu)有活性[4，7]。因此，藏菖蒲揮發(fā)油中的丁香酚、甲基丁香酚、γ-細(xì)辛醚類物質(zhì)可能為藏菖蒲揮發(fā)油的活性成分，但異丁香酚及其衍生物是否有活性尚待明確。故有必要對具有“C6-C3”母核物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行深入研究，明確其必需活性基團(tuán)，為后續(xù)安全、有效的藥物研究奠定基礎(chǔ)。此外，藏菖蒲揮發(fā)油中的萜類物質(zhì)是否具有殺傷活性亦需明確。