白玉玲 安坤杰 李興雙

摘要 目的：觀察清熱解毒、散風除翳法對細菌性角膜炎模型鼠的療效及其作用機制。方法：將60只Wistar大鼠隨機分為5組，即模型組、小劑量組、大劑量組、對照組以及空白組，每組12只大鼠。采用細菌性角膜炎動物模型癥狀評定觀察清熱解毒、散風除翳法的療效，通過細菌清除率、角膜細菌菌落計數(shù)，光學顯微鏡觀察大鼠角膜的病理組織學改變，并采用流式細胞儀檢測CD4+，CD8+及CD4+/CD8+的水平討論清熱解毒、散風除翳法的作用機制。結(jié)果：1）清熱解毒、散風除翳法可降低細菌性角膜炎性反應(yīng)狀評分，提高細菌清除率，改善角膜基質(zhì)層的病理結(jié)構(gòu);2）清熱解毒、散風除翳法可提高細菌性角膜炎模型鼠外周血血CD4+、CD8+的表達水平，具有劑量依賴性（P<0.05），CD4+/CD8+比值相對穩(wěn)定，各組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：清熱解毒，散風除翳法能有效改善細菌性角膜炎，其作用機制可能與上調(diào)大鼠外周血中CD4+，CD8+含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞 清熱解毒，散風除翳法;細菌性角膜炎;實驗研究;作用機制;流式細胞

Abstract Objective：To observe the therapeutic effect and mechanism of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating therapy on bacterial keratitis model mice. Methods：A total of 60 Wistar rats were randomly divided into 5 groups：model group（n=12），low dose group（n=12），high dose group（n=12），control group（n=12）and blank group（n=12）.The curative effect of clearing heat and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating was observed by evaluating the symptoms of the animal model of bacterial keratitis. The pathological and histological changes of rat cornea were observed by bacterial clearance rate， bacterial colony count of cornea and light microscope. The levels of CD4+， CD8+ and CD4+/CD8+ were detected by flow cytometry to discuss the mechanism of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating. Results：1）The method of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating could reduce the symptom score of bacterial keratitis， increase the bacterial clearance rate and improve the pathological structure of corneal stroma. 2）The method of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating could increase the expression level of CD4+ and CD8+ in peripheral blood of bacterial keratitis model rats in a dose-dependent manner（P<0.05），and the ratio of CD4+/CD8+ was relatively stable， and there was no significant difference among the five groups（P>0.05）. Conclusion：The method of clearing heat and detoxification， wind-dispelling and nebula-eliminating can effectively improve bacterial keratitis， and its mechanism may be related to the up-regulation of CD4+，CD8+ content in peripheral blood of rats.

Keywords Clearing away heat and detoxification;Wind-dispelling and nebula-eliminating; Bacterial keratitis; Experimental study;Mechanism of action;Flow cytometry

中圖分類號：R285.5;R276.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.012

細菌性角膜炎是以角膜上皮缺損及缺損區(qū)下角膜基質(zhì)壞死為主要病理變化的由細菌感染引起的眼病，是致盲的主要原因之一[1]。目前研究可知約87%[2-5]的細菌性角膜炎是感染細球菌科、鏈球菌科、假單胞菌科，腸桿菌科這4種致病菌引起的，抗生素治療是目前的主要手段，然而我們發(fā)現(xiàn)由于細菌耐藥性等因素導(dǎo)致兼具安全性和有效性的滴眼液的選擇尚存在較大爭議[6-8]。

中醫(yī)學并無細菌性角膜炎的病名記載，其屬于“凝脂翳”的范疇，首載于《證治準繩·雜病·七竅門》，在《審視瑤函·凝脂翳癥》一書中對此病的病因病機進行詳細的闡述，風熱邪毒侵襲機體，黑睛被染，外邪入里化熱，熱毒壅盛于里，影響氣機布散，壅滯蓄腐，黑睛潰陷而發(fā)此病。因此“清熱解毒，散風除翳”是治療本病的關(guān)鍵，在臨床中我們證實該療法確對細菌性角膜炎有理想療效，但其作用機制尚不明了，故我們利用細菌性角膜炎大鼠模型為媒介，以期探明清熱解毒，散風除翳法治療細菌性角膜炎的可能機制，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本次實驗所使用的動物均選擇清潔級的健康Wistar大鼠共60只（購于河北醫(yī)科大學動物中心），每只Wistar大鼠的體質(zhì)量（200±10）g，雌雄各30只，在進行本次實驗之前，所有的Wistar大鼠都進行外眼檢查，在確保未發(fā)現(xiàn)異常的Wistar大鼠方可入選本研究。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±1.5）℃，濕度（50±5）%，12 h/12 h晝夜交替。

1.1.2 藥物 清熱解毒，散風除翳法的中藥制劑均由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院藥房提供及煎煮，金銀花、天花粉、荊芥、防風、蒲公英、生地黃、黃芩、赤白芍、蟬蛻、白蒺藜、甘草組方上述11位中藥按一定比例配伍后，放置入煎煮器皿中，先用武火煎開后再使用文火煎煮約10 min，之后倒出藥液進行過濾，再將藥液進行加熱，使其濃縮至含生藥4.6 g/mL，自然冷卻后裝入密封瓶中以備用。

1.1.3 試劑與儀器 金黃色葡萄球菌標準菌株（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，產(chǎn)品ID號：VLK-091585）;血平板培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，貨號：024070）;CD4+流式細胞試劑盒（ThermoFisher Scientific有限公司，貨號：MA5-16134），CD8+流式細胞試劑盒（ThermoFisher Scientific有限公司，貨號：MA5-16802）;外周血淋巴細胞分離液試劑盒（Solarbio有限公司，貨號：P8630）;臺灣赫羅斯手持裂隙燈（北京澤澳醫(yī)療科技有限公司，中國，型號：ILS100），賽多利斯分析天平（蘇州金鉆稱重設(shè)備系統(tǒng)開發(fā)有限公司，型號：BSA124S），輪轉(zhuǎn)切片機（山東博科科學儀器有限公司，型號：BK-2178）;病理圖像分析儀（同濟醫(yī)科大學影像公司，型號：HPIAS-1000）;萬能照相機（Olympus公司，日本，型號：AHB-2-LB）;流式細胞儀（貝克曼公司，美國，型號：CytoFLEX）。

1.2方法

1.2.1 分組與模型制備 將60只Wistar大鼠隨機分為5組，即模型組、小劑量組、大劑量組、對照組、以及空白組，每組12只大鼠。菌落制備：本次實驗菌株選用金黃色葡萄球菌標準菌株，菌種濃度設(shè)定為2.5×1010 CFU/mL;在合適的生物安全防護條件，用吸管將0.5 mL普通瓊脂培養(yǎng)基注入金黃色葡萄球菌凍干粉安瓶中，吹打使其溶解成金黃色葡萄球菌懸液，在使用前的24 h將菌懸液接種于的血培養(yǎng)基并放置在37 ℃的恒溫箱進行培養(yǎng)，之后用0.45%的無菌NaCl溶液進行稀釋，經(jīng)細菌濃度比濁儀將其比濁為2 MC Farlands（約含6億CFU/mL）后備用。模型制備：除空白組大鼠外，其余4組大鼠均使用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉（麻醉劑量為每100 g體質(zhì)量0.3 mL），之后根據(jù)Hobden[9]接種法，在各組大鼠的眼角膜上滴1%鹽酸丁卡因滴眼液1滴進行眼部的麻醉，并將7號注射無菌針頭在大鼠角膜中央輕劃3條相互平行約2 mm長度劃痕，深度使其達到角膜的淺基質(zhì)層，將制備好的菌液用移液器滴在角膜劃痕上，20 μL/次，共滴3次[10]。24 h后采用手持裂隙燈、手電筒等工具對患眼進行觀察，當出現(xiàn)角膜渾濁及結(jié)膜明顯充血即為造模成功。

1.2.2 給藥方法 大鼠處理24 h后開始干預(yù)治療，空白組：不給藥;模型組：不給藥;小劑量組：按10倍成人劑量具有清熱解毒，散風除翳法的中藥對大鼠進行灌胃給藥治療;大劑量組：按20倍成人劑量具有清熱解毒，散風除翳法的中藥對大鼠進行灌胃給藥治療;對照組：經(jīng)過蒸餾水配制的阿莫西林膠囊水溶液，按成人劑量的20倍對大鼠灌胃給藥治療;3個觀察組患眼局部均采用0.5%左氧氟沙星滴眼液滴眼（4次/d），紅霉素眼膏涂眼（1次/d）進行外用藥治療。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 細菌性角膜炎動物模型癥狀評定 分別于給藥前、給藥2 d、給藥8 d、給藥14 d，采用手持裂隙燈、手電筒燈工具對患眼進行觀察，并根據(jù)表1的細菌性角膜炎動物模型癥狀評分標準，進行癥狀評分以此作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.3.2 細菌清除率 分別在給藥前、第2、8、14天對Wistar大鼠的眼角膜進行細菌菌株數(shù)的鑒定。將無菌棉簽浸潤無菌NaCl溶液對各組模型大鼠的上下眼瞼進行擦拭，后將擦拭過的棉簽放入無菌試管中，并裝入5 mL無菌NaCl溶液，充分浸泡搖勻，使用無菌注射器抽取0.5 mL液體放置于無菌培養(yǎng)皿之中與瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，將培養(yǎng)皿放置在37 ℃的培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)18 h，以觀察細菌清除率。細菌清除率的計算公式：細菌清除率=清除株/感染眼數(shù)×100%。

1.2.3.3 角膜細菌菌落計數(shù) 處死各組Wistar大鼠后，均摘取左側(cè)眼球，取下左眼的角膜，將角膜放置于10 mL無菌NaCl溶液的無菌試管中，并配置成3組濃度不同的菌液（濃度分別為1∶10、1∶100、1∶1 000），各比例的菌液抽取1 mL與15 mL滅菌消毒后的普通營養(yǎng)瓊脂混勻，放置入無菌培養(yǎng)皿中，置于37 ℃的恒溫箱中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)24 h進行菌落的分析計數(shù)。

1.2.3.4 光學顯微鏡觀察 處死各組Wistar大鼠后，均摘取右側(cè)眼球，放置在10%福爾馬林中進行石蠟包埋，后將其以3 μm石蠟切片，分別進行HE染色，在40×10倍光學顯微鏡下觀察大鼠角膜的病理組織學改變，每張經(jīng)過處理的病理切片分別選取10個視野（包括中央與周邊），并將其分別進行攝片取樣，在彩色病理圖像分析系統(tǒng)下進行分析，在觀察的同時進行多形核白細胞（PMN）的計數(shù)分析，然后取其各切片的均值進行PMN的半定量分析。

1.2.3.5 CD4+，CD8+，以及CD4+/CD8+的檢測 ? 每組Wistar大鼠在處死活檢前，分別抽取其外周靜脈血2 mL，進行EDTA抗凝，分離出大鼠淋巴細胞分離液，再從中提取外周單核細胞共200 μL，把所提取的外周單核細胞置于盛有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，再放置于5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，進行PBS沖洗，細胞收集，隨后將細胞使用SD流式儀細胞學檢測CD4+，CD8+，以及CD4+/CD8+，上述所有的操作流程均按相關(guān)操作說明書嚴格進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。評分數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，2樣本均數(shù)比較用t檢驗，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，若差異有統(tǒng)計學意義，采用最小顯著差異法做兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細菌性角膜炎的癥狀評分 治療前各組大鼠眼部混合充血加劇各組癥狀平差異無統(tǒng)計學意義。治療后第2天，模型組、治療小劑量組、治療大劑量組和治療對照組的癥狀評分均高于空白組（P<0.05），但4組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;治療后第8天，治療大劑量組、治療小劑量組、治療對照組的癥狀評分明顯低于模型組（P<0.05），高于空白組（P<0.05），其中治療大劑量組、治療小劑量組的癥狀評分均較治療對照組低（P<0.05），盡管治療大劑量組的癥狀評分較治療小劑量組評分更低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;治療后第14天，治療大劑量組、治療小劑量組、治療對照組3組的癥狀評分進一步降低且均低于模型組（P<0.05），高于空白組（P<0.05）;治療大劑量組、治療小劑量組、治療對照組3組間癥狀評分差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2 各組細菌清除率比較 在實驗的第2、8、14天對各組的細菌清除率進行觀察，結(jié)果顯示，第2天治療大劑量組、治療小劑量組與治療對照組之間的細菌清除率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;第8天，治療對照組的細菌清除率為46.1%，治療小劑量組的細菌清除率為55.2%，而治療大劑量組為72.8%，均明顯高于模型組的14.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P>0.05）;在第14天，治療對照組細菌的清除率為62.7%，治療小劑量組為71.1%，治療大劑量組為85.7%，也均明顯高于模型組（15.9%）（P<0.05）。

2.3 各組菌落計數(shù)比較 分別對各組大鼠的角膜菌落計數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明：模型組大鼠的角膜菌落計數(shù)均高于治療對照組、治療小劑量組和治療大劑量組，且模型組與各組的技術(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而空白組的角膜菌落計數(shù)均低于治療對照組、治療小劑量組和治療大劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）、其中角膜菌落計數(shù)由高到低分別為治療對照組、治療小劑量組、治療大劑量組，且各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4 光學顯微鏡下觀察角膜組織中多形核白細胞的半定量分析 模型組較之空白組，其角膜基質(zhì)層水腫更為明顯，且出現(xiàn)了空腔和前上皮的增生，角膜明顯增厚，可見明顯炎性浸潤，傷口周圍可見大量的主治壞死，深及一半的基質(zhì)，膠原纖維明顯腫脹，并可見大部分角膜上皮出現(xiàn)剝脫、變性。見圖1。而其余的治療對照組、治療小劑量組與治療大劑量組鏡下所見發(fā)生感染的角膜，其炎性浸潤與腫脹程度較輕，角膜未見明顯剝脫、變性，結(jié)構(gòu)趨于完整。對角膜組織中的PMN進行半定量分析，結(jié)果顯示，治療大劑量組、治療小劑量組的PMN均低于治療對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），同時治療小劑量組與治療對照組的PMN量也均低于模型組（P<0.05）。但治療大劑量組、治療小劑量組、治療對照組雖高于空白組，但各組間進行比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠外周血的CD4+、CD8+水平比較 ? 治療小劑量組、治療大劑量組血CD4+、CD8+的表達水平明顯高于治療對照組、模型組和空白組（P<0.05），其中治療大劑量組與治療小劑量組之間比較，以及空白組、治療對照組和模型組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;CD4+/CD8+比值相對穩(wěn)定，5組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

3 討論

細菌性角膜炎是臨床常見的嚴重威脅視力的眼科疾病之一，以眼痛、畏光、結(jié)膜充血、異物感、分泌物增多為主要臨床表現(xiàn)，是致盲的重要原因，該病發(fā)病急、進展迅速、變化多端，嚴重影響患者的生命質(zhì)量[12]。在常見的致病菌中金黃色葡萄球菌是致病力最強的菌種[13-15]，其產(chǎn)生的金黃色色素對甘露醇有較強的分解能力，金黃色葡萄球菌在生長過程中合成并分泌到外毒素，誘發(fā)產(chǎn)生血漿凝固酶、溶血毒素、殺白細胞素等[16-17]，入侵角膜導(dǎo)致局部產(chǎn)生炎性反應(yīng)效應(yīng)。目前臨床顯示廣譜抗菌藥對該病具有一定療效，而長時間抗生素滴眼液點眼，會使患者產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致患者對藥物的敏感性降，而且這類眼液均具有程度的上皮毒性，長期使用可導(dǎo)致干眼癥[18]，此外，隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，臨床細菌培養(yǎng)及藥敏結(jié)果的滯后，往往導(dǎo)致感染得不到及時控制，延誤病情。

中醫(yī)研究認為該病的病機黑睛外傷，風熱邪毒乘傷襲入，黑睛被染，外邪入里，蘊遏化熱，應(yīng)該使用清熱解毒，散風除翳法對細菌性角膜炎進行治療。本研究藥方由金銀花、天花粉、荊芥、防風、蒲公英、生地黃、黃芩、赤白芍、蟬蛻、白蒺藜、甘草組成，其中金銀花是清熱解毒明目的經(jīng)典中藥，現(xiàn)代研究顯示金銀花的藥理活性成分有明顯抑制金黃葡萄球菌的作用[19]。防風、荊芥可祛風散邪止痛，符合“火郁發(fā)之”之意;蒲公英、黃芩、蟬蛻可清肝瀉火退赤，現(xiàn)代藥理學研究顯示黃芩苷有明顯抗毒素作用;赤芍配生地黃共奏清熱活血，退赤止痛的效應(yīng)，白蒺藜有平肝解郁，祛風明目的作用，現(xiàn)代藥理學研究顯示甘草提取物有明顯提升機體免疫功能的作用[20]。經(jīng)過對大鼠對金黃色葡萄球菌引起的細菌性角膜炎的實驗研究表明，清熱解毒，散風除翳法中藥結(jié)合西醫(yī)抗生素治療本病能改善大鼠炎性反應(yīng)角膜的外眼形態(tài)，提高細菌清除率，降低炎性反應(yīng)角膜中PMN浸潤數(shù)目及細菌菌落數(shù)量，升高外周血中CD4+、CD8+含量，提高機體免疫力，從而加快炎性反應(yīng)消除，縮短潰瘍愈合時間。提示中西醫(yī)結(jié)合是一種療效確切、安全無不良反應(yīng)的治療細菌性角膜炎的方法，不良反應(yīng)小，安全可靠，而且治愈時間大大縮短，患者的治愈率也有明顯提高，可安全應(yīng)用于臨床，值得進一步的推廣和探究。

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（2019-09-27收稿 責任編輯：王明）