魯春花 趙凱 薩震

摘要 目的：運用系統(tǒng)藥理學(xué)探討大黃黃連瀉心湯對治療幽門螺旋桿菌感染的分子作用機(jī)制，挖掘潛在的作用靶點和信號通路。方法：首先利用中醫(yī)藥整合數(shù)據(jù)庫（SymMap）篩選大黃黃連瀉心湯的潛在作用靶點;從比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD）發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌感染的相關(guān)疾病靶點;將篩選后的靶點輸入到String中構(gòu)建“大黃黃連瀉心湯-幽門螺旋桿菌”的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）;采用在線分析工具WebGestalt對篩選出的靶點進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。結(jié)果：獲得大黃黃連瀉心湯和幽門螺旋桿菌感染重合的靶點共有222個，通過PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)71個相互作用靶點，其中主要以IL6、MYC、VEGFA、CASP3、EP300、IL10、ERBB2、CDKN1A、MPO、NFE2L2為關(guān)鍵靶點;發(fā)現(xiàn)10個關(guān)鍵生物過程和10條關(guān)鍵信號通路。結(jié)論：大黃黃連瀉心湯可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎性反應(yīng)，發(fā)揮對幽門螺旋桿菌感染的治療作用，同時可能通過抗腫瘤機(jī)制起到防止幽門螺旋桿菌感染進(jìn)一步向更嚴(yán)重胃腸道疾病轉(zhuǎn)化的作用。本研究為中醫(yī)藥治療幽門螺旋桿菌提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 大黃黃連瀉心湯;幽門螺旋桿菌;系統(tǒng)藥理學(xué);胃癌;網(wǎng)絡(luò)分析

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction in the treatment of helicobacter pylori infection by systematic pharmacology，and to explore potential targets and signal pathways.Methods：First，the integrated Chinese medicine database （SymMap） was used to screen the potential targets of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction; the relevant disease targets of helicobacter pylori infection was found from the comparative toxicology genomics database （CTD）; the protein interaction network （PPI） of “Dahuang Huanglian Xiexin Decoction-Helicobacter pylori” was constructed in String after the screened target entered into it; the online analysis tool WebGestalt was used to perform GO function annotation and KEGG pathway enrichment analysis on the selected targets.Results：There were 222 overlapping targets of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction and Helicobacter pylori infection coinciding.A total of 71 interactive targets were located through the PPI network.Among them，IL6，MYC，VEGFA，CASP3，EP300，IL10，ERBB2，CDKN1A，MPO and NFE2L2 were key targets; 10 key biological processes and 10 key signaling pathways were discovered.Conclusion：Dahuang Huanglian Xiexin Decoction may play a therapeutic role in the treatment of helicobacter pylori infection by regulating the body′s immune inflammatory response and at the same time it may prevent the infection of helicobacter pylori from further transforming to more severe gastrointestinal diseases by anti-tumor mechanism.This study provides solid theoretical basis for TCM treatment of helicobacter pylori.

Keywords Dahuang Huanglian Xiexin Decoction; Helicobacter pylori; Systematic pharmacology; Gastric cancer; Network analysis

中圖分類號：R285.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.005

幽門螺旋桿菌（Helicobacter Pylori，Hp）是一種能夠吸附在胃的上皮細(xì)胞的革蘭氏陰性、微需氧性、對生長條件要求十分苛刻的細(xì)菌。1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中將幽門螺旋桿菌分離成功，主要寄生在人的胃里，是目前所知能夠在人胃中生存的唯一微生物種類，目前，西醫(yī)殺滅幽門螺旋桿菌主要采用三聯(lián)療法，包括使用奧美拉唑、阿莫西林和克拉霉素持續(xù)10～14 d的療程。值得警惕的是，由于克拉霉素的耐藥性上升，導(dǎo)致幽門螺旋桿菌的根除率正在下降[1]。此外，臨床上還有在三聯(lián)的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用鉍劑，但是鉍劑使用不當(dāng)會引起急性腎衰竭[2-3]。中醫(yī)中藥治療幽門螺旋桿菌感染有獨特的優(yōu)勢，中醫(yī)一般認(rèn)為幽門螺旋桿菌感染屬于脾胃積熱，治療上通常可以采用清熱化濕，清熱解毒等治療思路。大黃黃連瀉心湯出自《傷寒論》，原方由大黃、黃連、黃芩3味藥組成。大黃能清熱瀉火、涼血解毒，黃連和黃芩均能清熱燥濕、瀉火解毒，但黃連清熱燥濕之力勝于黃芩，擅長清中焦脾胃濕熱?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究，大黃的化學(xué)成分主要是蒽醌衍生物，有抗感染作用，對多種革蘭氏陽性和陰性菌有抑制作用;黃連主要有效成分包括黃連堿、小檗堿，對金黃色葡萄球菌有抑制作用;黃芩有效成分主要是黃芩苷和黃芩素，對革蘭氏陰性菌有不同程度的抑制作用[4]。大黃黃連瀉心湯能與多種組方配伍，在中醫(yī)臨床上廣泛用來治療消化道炎性反應(yīng)[5]，但治療機(jī)制還有待研究。近年來，系統(tǒng)藥理學(xué)的發(fā)展為中醫(yī)藥研究提供了新的研究方法[6]，從而為系統(tǒng)深入的揭示中醫(yī)藥對疾病和機(jī)體的相互作用機(jī)制提供了幫助，促進(jìn)了中藥新藥的研發(fā)。本研究主要用系統(tǒng)藥理學(xué)的方法探討大黃黃連瀉心湯對幽門螺旋桿菌感染的治療作用，構(gòu)建大黃黃連瀉心湯的關(guān)聯(lián)性網(wǎng)絡(luò)模型，篩選關(guān)鍵治療靶標(biāo)，對其進(jìn)行功能分析，明確其有效組份對幽門螺旋桿菌的作用機(jī)制，拓展其在臨床上使用大黃黃連瀉心湯為基礎(chǔ)的中醫(yī)組方治療治伴隨幽門螺旋桿菌感染的胃炎及胃潰瘍的可能性。

1 材料與方法

1.1 大黃黃連瀉心湯的作用靶點篩選 首先通過中醫(yī)藥整合數(shù)據(jù)庫SymMap[7]（An integrative database of traditional Chinese Medicine enhanced by symptom mapping，https：//www.symmap.org/）分別輸入大黃黃連瀉心湯中大黃、黃連、黃芩3味中草藥的名稱，選擇參數(shù)P<0.05，篩選出其潛在的作用靶點。該平臺將傳統(tǒng)中醫(yī)藥的癥狀描述和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子作用機(jī)制整合在了一起，將疾病-癥狀-中草藥-成分-靶標(biāo)關(guān)聯(lián)到一起，并通過直接或間接統(tǒng)計推斷形成關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2 幽門螺旋桿菌感染相關(guān)疾病靶點預(yù)測 通過比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫CTD[8]（Comparative Toxicogenomics Database，http：//ctdbase.org/），輸入“Helicobacter Infections”，獲取幽門螺旋桿菌感染的疾病潛在靶點。

1.3 藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將大黃黃連瀉心湯的藥物潛在作用靶點與幽門螺旋桿菌感染的相關(guān)疾病靶點數(shù)據(jù)進(jìn)行重疊處理，將2組數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入韋恩圖在線繪制工具Draw Venn Diagrams[9]（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），即可發(fā)現(xiàn)大黃黃連瀉心湯與幽門螺旋桿菌感染的交集靶點。

1.4 預(yù)測作用靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶標(biāo)的篩選 將大黃黃連瀉心湯和幽門螺旋桿菌感染交集靶點輸入String[10]（Protein-Protein Interaction Networks，PPI，https：//string-db.org/），構(gòu)建篩選出的靶點之間的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。在String中首先選擇“Multiple proteins”，然后輸入上述靶點信息，選擇“Homo sapiens”，選擇最低相互作用得分為0.4，作為篩選靶點相互作用關(guān)系的參數(shù)。將String中獲得的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2[11]軟件中，從而使PPI互作關(guān)系可視化。使用Cytoscape中的Tool-Network Analysis-Generate Style from Statistics工具，按照網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)進(jìn)行可視化調(diào)整。

1.5 相關(guān)靶點的GO功能分析和KEGG通路富集分析 通過在線基因分析工具包WebGestalt[12]（Web-based Gene Set Analysis Toolkit，http：//www.webgestalt.org/）對大黃黃連瀉心湯作用于幽門螺旋桿菌感染的相關(guān)靶點進(jìn)行GO（Geneontology）功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)大黃黃連瀉心湯的主要作用信號通路，并對富集結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 大黃黃連瀉心湯治療幽門螺旋桿菌感染的靶點預(yù)測和篩選 從SymMap數(shù)據(jù)庫中查找到大黃的作用靶點有72個，黃連的作用靶點有140個，黃芩的作用靶點有106個，將三者做重合比較之后共篩選得到大黃黃連瀉心湯的成分作用靶點268個，作為候選靶點。從CTD數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)潛在的幽門螺旋桿菌感染相關(guān)疾病靶點共8 048個。將大黃黃連瀉心湯的靶點和幽門螺旋桿菌感染的疾病靶點作韋恩圖重疊繪制后取交集，共得到222個藥物-疾病作用靶點。見圖1。

2.2 大黃黃連瀉心湯對幽門螺旋桿菌感染作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)String的PPI網(wǎng)絡(luò)計算結(jié)果最終得到71個相互作用節(jié)點（Nodes），367條邊（Edges），PPI網(wǎng)絡(luò)富集P值<1.0e-16，有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)包括自由度（Degree）表示網(wǎng)絡(luò)中該節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)，用節(jié)點的大小表示，自由度越高，點越大;節(jié)點的接近中心性（Closeness）為該節(jié)點與其他節(jié)點的接近程度，用節(jié)點的顏色來表示，顏色越深表明關(guān)聯(lián)性越大;關(guān)聯(lián)性評分（Combined score）表示2個節(jié)點之間的關(guān)聯(lián)性強度，用邊的粗細(xì)來表示，邊越粗意味著關(guān)聯(lián)性越強。由String顯示該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的平均Degree為9.79，平均聚類系數(shù)為0.579。利用Cytoscape中的cytoHubba插件根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Degree篩選出排序最高的前10個關(guān)鍵節(jié)點，包括：IL-6（白細(xì)胞介素-6），MYC（MYC原癌基因），VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子A），CASP3（caspase3），EP300（E1A結(jié)合蛋白p300），IL-10（白細(xì)胞介素-10），ERBB2（Erb-b2受體酪氨酸激酶2），CDKN1A（細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑1A），MPO（髓過氧化物酶），NFE2L2（核因子 紅細(xì)胞樣2）。節(jié)點的顏色越深，表明得分越高。見圖3。

2.3 預(yù)測作用靶點的GO功能分析 將通過PPI構(gòu)建獲得的71個相互作用靶點輸入到WebGestalt在線工具中，依次選擇“Homo sapiens”“Over-Representation Analysis”“geneontology”“Biological Process”，即可得到GO分析結(jié)果。見表1和圖5。涉及的GO過程主要包括：對含氧化合物的反應(yīng)，對非生物刺激的反應(yīng)，對藥物的反應(yīng)，對脂質(zhì)的反應(yīng)，對氧氣水平的反應(yīng)，對氧氣水平降低的反應(yīng)，對缺氧的反應(yīng)，對活性氧的反應(yīng)，對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)，對無機(jī)物的反應(yīng)。綜上可以看出，大黃黃連瀉心湯對幽門螺旋桿菌的作用靶點主要集中在對各種氧化代謝的反應(yīng)過程中。見圖4。

2.4 預(yù)測作用靶點的KEGG通路富集分析 再將71個相互作用靶點輸入到WebGestalt在線工具中，依次選擇“pathway”“KEGG”，即可獲得KEGG通路富集分析結(jié)果。見表2。其中主要包括細(xì)胞周期，癌癥途徑，p53信號通路，前列腺癌，HIF-1信號通路，F(xiàn)oxO信號通路，細(xì)胞衰老，膀胱癌，PI3K-Akt信號通路，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路。見圖6。

[8]Davis AP，Grondin CJ，Johnson RJ，et al.The Comparative Toxicogenomics Database：update 2019[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D948-D954.

[9]Heydari，M.，Miclotte，G.，Demeester，P.，et al.Evaluation of the impact of Illumina error correction tools on de novo genome assembly[J].BMC Bioinformatics，2017，374（18）.https：//doi.org/10.1186/s12859-017-1784-8.

[10]Franceschini A，Szklarczyk D，F(xiàn)rankild S，et al.STRING v9.1：protein-protein interaction networks，with increased coverage and integration[J].Nucleic Acids Res，2013，41：D808-815.

[11]Shannon P，Markiel A，Ozier O，et al.Cytoscape：a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J].Genome Res，2003，13（11）：2498-2504.

[12]Wang J，Vasaikar S，Shi Z，et al.WebGestalt 2017：a more comprehensive，powerful，flexible and interactive gene set enrichment analysis toolkit[J].Nucleic Acids Res，2017，45（W1）：W130-137.

[13]Mandeville KL，Krabshuis J，Ladep NG，et al.Gastroenterology in developing countries：issues and advances[J].World J Gastroenterol，2009，15（23）：2839-2854.

[14]Mladenova I，Durazzo M.Transmission of Helicobacter pylori[J].Minerva Gastroenterol Dietol，2018，64（3）：251-254.

[15]JKY H，Lai WY，Ng WK，et al.Global Prevalence of Helicobacter pylori Infection：Systematic Review and Meta-Analysis[J].Gastroenterology，2017，153（2）：420-429.

[16]Weeks DL，Eskandari S，Scott DR，et al.A H+-gated urea channel：the link between Helicobacter pylori urease and gastric colonization[J].Science，2000，287（5452）：482-485.

[17]Ramarao N，Gray-Owen SD，Meyer TF.Helicobacter pylori induces but survives the extracellular release of oxygen radicals from professional phagocytes using its catalase activity[J].Mol Microbiol，2000，38（1）：103-113.

[18]Censini S，Stein M，Covacci A.Cellular responses induced after contact with Helicobacter pylori[J].Curr Opin Microbiol，2001，4（1）：41-46.

[19]Sjomina O，Pavlova J，Niv Y，et al.Epidemiology of Helicobacter pylori infection[J].Helicobacter，2018，23（1）：e12514.

[20]Wroblewski LE，Peek RM.Helicobacter pylori in gastric carcinogenesis：mechanisms[J].Gastroenterol Clin North Am，2013，42（2）：285-298.

[21]崔曉春，趙鳴芳，凌云.《傷寒論》五瀉心湯煎煮法探析[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2018，24（1）：116-117，136.

[22]袁嘉嘉，顧超，孫志廣，等.“炎—癌轉(zhuǎn)化”的病因病機(jī)——以慢性萎縮性胃炎為例[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，34（4）：624-626.

[23]De la Fuente M，F(xiàn)ranchi L，Araya D，et al.Escherichia coli isolates from inflammatory bowel diseases patients survive in macrophages and activate NLRP3 inflammasome[J].Int J Med Microbiol，2014，304（3-4）：384-392.

[24]Trop-Steinberg S，Azar Y.Is Myc an Important Biomarker？ Myc Expression in Immune Disorders and Cancer[J].Am J Med Sci，2018，355（1）：67-75.

[25]雷楠，熊思會，譚溧，等.野黃芩苷通過hedgehog信號通路抑制結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞分化的研究[J/OL].中國中藥雜志：1-10.[2020-01-21].https：//doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm.20200108.401.

[26]張東梅，卿晨.血管內(nèi)皮生長因子家族及其受體與腫瘤血管新生[J].醫(yī)學(xué)綜述，2017，23（3）：417-420，427.

[27]Riedl S J，Shi Y.Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2004，5（11）：897-907.

[28]Waldum HL，F(xiàn)ossmark R.Types of Gastric Carcinomas[J].Int J Mol Sci，2018，19（12）：4109.

[29]Lahner E，Carabotti M，Annibale B.Treatment of Helicobacter pylori infection in atrophic gastritis[J].World J Gastroenterol，2018，24（22）：2373-2380.

（2020-01-23收稿 責(zé)任編輯：王明）