王鑫鵬 崔現(xiàn) (赤峰市醫(yī)院肛腸外科，內(nèi)蒙古 赤峰 04000；延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科)

結(jié)腸癌也稱(chēng)為大腸腺癌，是第五大致命癌癥，2018年預(yù)計(jì)死亡551 000例，占所有癌癥死亡的5.8%〔1〕。在發(fā)展中國(guó)家，其發(fā)病率正在穩(wěn)步上升。結(jié)腸癌0～74歲時(shí)，死于結(jié)腸癌的累積風(fēng)險(xiǎn)在男性中為0.66%，女性為0.44%〔1〕。盡管有許多治療方法，如外科手術(shù)、外科手術(shù)結(jié)合化學(xué)療法和放射療法，但結(jié)腸癌的中位生存率仍然很差。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性的小RNA分子，長(zhǎng)度為18～25 nt。miRNA與靶基因mRNA的3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合后，可介導(dǎo)其降解或抑制其轉(zhuǎn)錄，因此起到調(diào)控基因功能的作用〔2〕。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，靶向miRNA可作為治療腫瘤的潛在手段〔3～6〕。本研究檢測(cè)一種miRNA分子miR-144-5p在結(jié)腸癌中的表達(dá)，并研究其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抗凋亡和轉(zhuǎn)移的影響，旨在為結(jié)腸癌分子靶向治療提供一種新的手段。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司，培養(yǎng)基為10%胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，每3天傳代1次。

1.2主要試劑和儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自BI公司，噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自碧云天科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR預(yù)混液購(gòu)自莫納公司。TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.3MTT分析 將轉(zhuǎn)染了miRNA的SW480細(xì)胞接種在96孔板上，然后用15 μlMTT(5 mg/ml)處理4 h。然后除去含有MTT溶液的培養(yǎng)基，再次添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)。然后使用550型酶標(biāo)儀(Bio-Rad，PA，USA)測(cè)定490 nm處的分光光度吸光度。每個(gè)測(cè)定重復(fù)3次。

1.4凋亡測(cè)定 轉(zhuǎn)染后，通過(guò)離心收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。每個(gè)樣品都用FITC-Annexin V和碘化丙啶(PI)雙重染色。以1 mg/ml最終濃度添加FITC-Annexin V(Boehringer Mannheim，德國(guó)Mannheim)，然后添加10 mg/ml PI。將混合物在黑暗中于室溫下孵育15 min，并使用FACScan流式細(xì)胞儀對(duì)1×104個(gè)細(xì)胞的熒光進(jìn)行定量。每個(gè)測(cè)定重復(fù)3次。

1.5RNA提取和RT-PCR 使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從細(xì)胞中提取總RNA。使用EasyScript第一鏈cDNA合成SuperMix(TransGen Biotech，北京，中國(guó))合成cDNA，并將其用作定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)中的模板。使用TransStartTMSYBR Green qPCR Supermix(TransGen Biotech)在7300 PCR系統(tǒng)(ABI，卡爾斯巴德，美國(guó))上進(jìn)行PCR反應(yīng)。 miR-144-5p引物和內(nèi)部參考U6購(gòu)自廣州日寶生物技術(shù)有限公司(中國(guó)廣州)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)RNA水平。

1.6菌落形成試驗(yàn) 用菌落形成測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞的克隆形成性。將細(xì)胞接種到3.5 cm板中。處理后，將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每3天更換一次新培養(yǎng)基。溫育14 d后，計(jì)數(shù)包含直徑大于75 μm的球體孔數(shù)量。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。

1.7細(xì)胞刮擦測(cè)試 在用miRNA轉(zhuǎn)染后，將SW480細(xì)胞處理的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)到6孔板中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，沿標(biāo)記線刮擦板表面；將細(xì)胞用PBS漂洗2次，并洗去浮細(xì)胞。然后將細(xì)胞添加到McCoy的5a培養(yǎng)基中，并置于37°C的5%CO2培養(yǎng)箱中，并在飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下分別在0 h和24 h對(duì)細(xì)胞照相。使用Imagetool軟件計(jì)算愈合面積，愈合率=(初始劃痕寬度-已存在的劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-144-5p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá) 腫瘤組織中miR-144-5p表達(dá)水平(0.31±0.17)明顯低于正常組織(1.00±0.22，P<0.01)。 在Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌組織中，miR-144-5p表達(dá)(0.22±0.10)明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期(0.54±0.20、0.43±0.14，P<0.01)。

2.2miR-144-5p在體外抑制遷移和侵襲 細(xì)胞刮擦試驗(yàn)結(jié)果表明，與用擾亂的miRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用miR-144-5p模擬物轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞的刮擦修復(fù)率更低，如圖1。

圖1 miR-144-5p抑制體外遷移(×200)

2.3miR-144-5p抑制SW480細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡 用miR-144-5p轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞活力(0.37±0.09)明顯低于Scramble轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞(0.94±0.16，P<0.01)。miR-144-5p轉(zhuǎn)染在體外顯著增強(qiáng)了SW480細(xì)胞的自發(fā)凋亡，miR-144-5p組細(xì)胞凋亡(17.2%)明顯高于Scramble組(5.8%)及對(duì)照組(5.4%，P<0.01)。結(jié)果表明，miR-144-5p可以調(diào)節(jié)SW480細(xì)胞的增殖和凋亡。

2.4miR-144-5p抑制SW480細(xì)胞中集落形成和腫瘤生長(zhǎng) 菌落形成試驗(yàn)表明，增強(qiáng)的miR-144-5p表達(dá)使菌落形成數(shù)目〔(58.4±6.9)個(gè)〕明顯少于Scramble組〔(118.2±10.1)個(gè)〕和對(duì)照組〔(123.4±10.7)個(gè)，P<0.01〕。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-144-5p的給藥極大地抑制了SW480腫瘤異種移植的生長(zhǎng)，miR-144-5p組腫瘤體積〔(692.7±96.3)mm3〕明顯低于Scramble組〔(189.6±137.2)mm3〕和對(duì)照組〔(1 134.2±148.4)mm3,P<0.01〕。

3 討 論

最近研究表明，miR-144-5p可作為疾病中的有效生物標(biāo)志物〔3～8〕。Satoh等〔3〕報(bào)道，與健康人相比，阿爾茨海默病患者血液樣本中的miR-144-5p和其他26種miRNA的表達(dá)失調(diào)，這可能與神經(jīng)元突觸功能有關(guān)。與健康對(duì)照組相比，抑郁/焦慮癥患者的血漿miR-144-5p水平顯著降低，且與抑郁評(píng)分呈負(fù)相關(guān)〔4〕。在各種類(lèi)型的腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了異位miR-144-5p表達(dá)，包括甲狀腺癌〔5〕、食道癌〔6〕、乳腺癌〔7〕和胃癌〔8〕。但在結(jié)腸癌中的表達(dá)仍然未知，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-144-5p表達(dá)的水平顯著下調(diào)，與具有較高miR-144-5p表達(dá)的患者相比，具有較低miR-144-5p的患者表現(xiàn)出較高的Ki67指數(shù)和較短的PFS，結(jié)果強(qiáng)烈表明miR-144-5p可作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌預(yù)后的有價(jià)值的生物標(biāo)志物〔8〕。

通過(guò)Dicer1對(duì)pre-miRNA進(jìn)行加工會(huì)生成一個(gè)miRNA雙鏈體，該雙鏈體由引導(dǎo)鏈和過(guò)客鏈組成。通常，傳代鏈miRNA沒(méi)有調(diào)節(jié)活性。但傳代鏈miR-144-3p的抑癌作用已有充分文獻(xiàn)記載〔9～13〕，而對(duì)miR-144-5p(來(lái)自pre-miR-144的引導(dǎo)鏈)的功能的了解仍然很少。據(jù)報(bào)道，miR-144-5p抑制人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗微生物反應(yīng)。Matsushita等〔14〕報(bào)道，miR-144-5p在膀胱癌中被下調(diào)，功能獲得研究表明miR-144-5p抑制癌細(xì)胞的增殖。本文結(jié)果表明，miR-144-5p表達(dá)的恢復(fù)不僅在體內(nèi)外都誘導(dǎo)了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡和生長(zhǎng)停滯，而且還抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上，miR-144-5p在體外和體內(nèi)能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并在體外促進(jìn)其自發(fā)凋亡。另外miR-144-5p還可以抑制腫瘤的遷移和侵襲。靶向miR-144-5p可能是預(yù)防結(jié)腸癌進(jìn)展的有效策略。