張典文 王培翠 武文輝

(青島市海慈醫(yī)療集團(tuán) 1心血管二科，山東 青島 266000；2功能檢查科心電圖室)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)通常會(huì)導(dǎo)致心臟病發(fā)作、腦卒中甚至死亡〔1，2〕。在動(dòng)脈中有斑塊形成時(shí)，流向某些器官的血液通常受到阻礙。目前AS與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因〔3，4〕。miRNA為短鏈的非編碼微小RNA，在機(jī)體多種疾病的發(fā)生發(fā)展中占重要地位〔5〕。據(jù)報(bào)道，miR-217在人類的多種癌癥中均有表達(dá)，在心血管疾病中也有報(bào)道〔6，7〕，但具體的作用機(jī)制尚未十分清楚。軟脂?；椎鞍譙prouty(SPRY1)可負(fù)向調(diào)控多種信號(hào)通路的調(diào)控，如MAPK、MAPK/ERK、FGF、EGF等〔8，9〕。SPRY1與miR-217在心血管疾病中的作用機(jī)制尚未清楚。本研究將構(gòu)建高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926損傷，檢測(cè)其中miR-217、SPRY1的表達(dá)，探討miR-217調(diào)控高糖誘導(dǎo)的EAhy926細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展的功能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；改良都市培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自invitrogen；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自MCE；LipofectamineTM2000購(gòu)自日本Takara；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自Millipore；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自南京建成生物研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926用混有血清的DMEM在常規(guī)條件下培養(yǎng)、傳代。

1.3細(xì)胞模型的建立與分組 按照徐茂鳳等〔10〕的方法，用25 μmol/ml高糖處理EAhy926細(xì)胞12 h為HG組。用5 μmol/ml高糖處理EAhy926細(xì)胞12 h為NG組。將anti-miR-con、anti-miR-217、pcDNA、pcDNA-SPRY1、anti-miR-217+si-con、anti-miR-217+si-SPRY1用3～5倍脂質(zhì)體混勻，轉(zhuǎn)染至EAhy926細(xì)胞，然后再用25 μmol/ml的高糖處理，分別為HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-217組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-SPRY1組、HG+anti-miR-217+si-con組、HG+anti-miR-217+si-SPRY1組，轉(zhuǎn)染8 h后，添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用qRT-PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率良好，以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-217、SPRY1表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其作為模板用于qRT-PCR試劑盒檢測(cè)miR-217、SPRY1表達(dá)。結(jié)果用2-△△Ct計(jì)算miR-217、SPRY1的表達(dá)水平。引物信息(5′-3′)：miR-217上游引物TGCCATGAAATAAATGTCTGTGC，下游引物AGGTGTTTTAGCATCTTGGGC；SPRY1上游引物GAGGCCAGAGCTCAGAGTGGCAAC，下游引物TGTTGGTTTTTCAAAGTTCCTAGG。內(nèi)參U6和GAPDH的引物為常用引物序列，由上海吉瑪公司合成。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞SPRY1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總蛋白并變性后，取上清用于蛋白電泳，然后將蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜；將膜用2.5%脫脂奶粉封閉處理，加入Ⅰ抗(1∶500～1∶1 500)4℃過(guò)夜，再加Ⅱ抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。最后用ECL發(fā)光試劑盒顯影曝光。蛋白條帶的灰度表示蛋白的表達(dá)水平。

1.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集細(xì)胞，取約104個(gè)細(xì)胞置于24孔板中加入MTT反應(yīng)溶液和二甲基亞砜(DMSO)溶液，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度(A)。

1.7Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，洗滌后用結(jié)合緩沖液懸浮，再加入Annexin V-FITC、PI各5 μL避光反應(yīng)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。細(xì)胞的凋亡率為早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

1.8生物信息學(xué)分析 采用在線靶基因預(yù)測(cè)庫(kù) target scan(http：//www.targetscan.org/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-455-3p的靶基因。

1.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-217與SPRY1的靶向結(jié)合 根據(jù)上述預(yù)測(cè)到的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成含有結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒(SPRY1-WT)和突變序列(SPRY1-MUT)，送由吉瑪公司完成。將SPRY1-WT、SPRY1-MUT克隆至熒光素酶報(bào)告載體psiCHECK2，構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒。將其與miR-NC、miR-217共轉(zhuǎn)染，然后檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。具體操作方法按照雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)試劑盒要求操作，記錄螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以二者的比值表示miR-217與SPRY1的結(jié)合力。比值越小結(jié)合力越強(qiáng)，比值越大結(jié)合力相對(duì)較弱。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用軟件PEMS3.2進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-217和SPRY1表達(dá)的影響 與NG組比較，HG組miR-217發(fā)生明顯升高，SPRY1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表1,圖1。

表1 miR-217和SPRY1在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)

圖1 Western印跡檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SPRY1蛋白表達(dá)

2.2抑制miR-217調(diào)控高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖 與NG組比較，HG組miR-217表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低，P21蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組miR-217表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞活性明顯上調(diào)，P21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p53和p21蛋白表達(dá)

表2 干擾miR-217和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

2.3抑制miR-217調(diào)控高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 與NG組相比，HG組細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(均P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組凋亡率明顯下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖3，圖4，表3。

圖3 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖4 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白

表3 干擾miR-217和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

2.4miR-217靶向SPRY1 運(yùn)用target scan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-217與SPRY1 3′UTR之間存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5)；miR-217明顯抑制WT-SPRY1細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)，不影響MUT-SPRY1細(xì)胞的熒光素酶活性(P>0.05)；miR-217組SPRY蛋白表達(dá)(0.18±0.03)顯著低于miR-con組(0.61±0.07);anti-miR-217組(0.88±0.09)顯著高于anti-miR-con(0.64±0.06)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖6，表4。

圖5 miR-217靶向SPRY1 3′UTR的序列信息

圖6 Western印跡檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SPRY1蛋白表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5過(guò)表達(dá)SPRY1調(diào)控高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖凋亡 與NG組比較，HG組SPRY1蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞活性明顯下調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2和p21蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.05)；與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-SPRY1組SPRY1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白表達(dá)明顯下降，Bcl-2和p21蛋白表達(dá)均明顯上升(均P<0.05)，見(jiàn)圖7和表5。

圖7 Western印跡檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白表達(dá)

表5 過(guò)表達(dá)SPRY1和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6干擾miR-217和沉默SPRY1對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與NG組比較，HG組SPRY蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞凋亡率上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組SPRY蛋白表達(dá)上升，細(xì)胞活性上調(diào)，細(xì)胞凋亡率下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與HG+anti-miR-217+si-con組比較，HG+anti-miR-217+si-SPRY1組SPRY蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6和圖8。

表6 干擾miR-217和沉默SPRY1對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.7抑制miR-217聯(lián)合沉默SPRY1調(diào)控高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白 與NG組比較，HG組Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2、p21蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組Bax、Bcl-2、p21蛋白表達(dá)發(fā)生相反的調(diào)控，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與HG+anti-miR-217+si-con組相比，HG+anti-miR-217+si-SPRY1組Bax、Bcl-2、p21的蛋白表達(dá)發(fā)生與HG組相同的調(diào)控作用。見(jiàn)圖9，表7。

圖9 Western印跡檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白表達(dá)

表7 干擾miR-217和沉默SPRY1對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白影響

3 討 論

miRNA在人類的各種疾病中均具有重要的調(diào)控作用，包括心力衰竭、心肌梗死及心血管其他疾病〔11〕。miR-217參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在心血管疾病中也具有重要作用。Zhang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-217在心臟黏液瘤中的表達(dá)異常降低，過(guò)表達(dá)miR-217可抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，其作用機(jī)制與miR-217靶向調(diào)控白細(xì)胞介素(IL)-6的表達(dá)。劉宇等〔13〕研究報(bào)道，在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中miR-217的表達(dá)水平明顯上調(diào)，可靶向與內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)的多個(gè)靶基因的表達(dá)。本研究結(jié)果與劉宇等〔13〕研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-217可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，這是首次發(fā)現(xiàn)miR-217在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的功能，為miR-217在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的潛在價(jià)值的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)；深入研究，驗(yàn)證了miR-217可靶向負(fù)調(diào)控SPRY1的表達(dá)，為miR-217在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制的探索提供參考依據(jù)。

SPRY1為Spry 基因家族的一員，具有該家族的抑制血管生成作用〔14，15〕。Friesel等〔16〕報(bào)道，SPRY1上調(diào)可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Matrigel上的管形成、抗血管生成因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑肽酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑f1。Yang等〔17〕報(bào)道，Spry1對(duì)MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)幾乎沒(méi)有影響，但在血管平滑肌細(xì)胞中增加并維持Akt活化，體外血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)需要持續(xù)的Akt信號(hào)傳導(dǎo)，而ERK信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)Akt活化和血管平滑肌標(biāo)志物基因表達(dá)。Lu等〔18〕通過(guò)ApoE建立小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，SPRY1在AS組織中的表達(dá)水平明顯降低，且可作為miR-29b的靶基因調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎性因子表達(dá)及MAPK信號(hào)通路的活性，提示miR-29b/SPRY1/MAPK信號(hào)通路具有治療AS的潛力。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果均相一致；過(guò)表達(dá)SPRY1后，具有與抑制miR-217表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)和凋亡抑制的相同作用，這與SPRY1在AS中的抗炎保護(hù)作用相呼應(yīng)，為SPRY1的功能研究提供了新的理論參考；深入研究發(fā)現(xiàn)，沉默SPRY1可逆轉(zhuǎn)抑制miR-217對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)和凋亡抑制作用，說(shuō)明不僅miR-217可靶向抑制SPRY1的表達(dá)，SPRY1也可逆向負(fù)調(diào)控miR-217對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)和功能。

綜上，抑制miR-217可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與miR-217靶向負(fù)調(diào)控SPRY1的表達(dá)有關(guān)，為糖尿病心血管疾病的治療提供新方向。