易偉 張旭東，2 蔣雯雯 韋登明

(1寧波大學醫(yī)學院病理學系，浙江 寧波 315211;2湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心)

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種常見病和多發(fā)病，但其發(fā)病機制仍然不是十分清楚。近年來研究表明RA的發(fā)生與輔助性T細胞17型/調(diào)節(jié)性T細胞(Th17/Treg)的失衡有關〔1，2〕。維甲酸相關核孤受體(ROR)γt mRNA通過調(diào)控Th17細胞，增加其分泌白細胞介素(IL)-17、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種細胞因子的水平而加重炎癥反應。Treg細胞是一類CD4+T細胞亞群，受轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白(Fox)p3 mRNA調(diào)控，Treg可通過分泌抑炎因子(IL-10、TGF-β、IL-35等)來抑制免疫應答和炎性反應〔3〕。前期研究表明海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞可修復兔佐劑性關節(jié)炎軟骨缺損，并且有明顯的抗炎作用，但其抗炎作用不是十分清楚〔4〕。而海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞對于RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的影響未見報道。本文旨在探討海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞調(diào)節(jié)RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平抗兔佐劑性關節(jié)炎的機制。

1 實驗材料

1.1實驗動物 從浙江省余姚泗門鎮(zhèn)建飛實驗兔養(yǎng)殖場〔許可格證號：SCXK(浙)2012-0050〕購入40只新西蘭兔(清潔級，二月齡，體重2～3 kg，雄性)。適應性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為對照組(A組)，模型組(B組)，細胞治療組(C組)，支架治療組(D組)，支架復合細胞組(E組)各8只。

1.2實驗試劑 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)；兔抗TGF-β1多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；TGF-β1、胰島素樣生長因子(IGF)-1(美國peprotech公司)；阿利新藍(上海生工生物工程有限公司)；EasyPure?RNA Kit、2×TransTaq?High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix、EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)；完全弗佐劑(FCA)、海藻酸鈉粉劑(美國sigma公司)；UltraPower?DNA染料、6×上樣緩沖液(北京百泰克生物技術有限公司)。

1.3實驗儀器 臺式超高速低溫離心機(Centrifuge 5810R，德國Eppendorf 公司)、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher Scientific公司)、包埋機(BM-Ⅶ，宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)、石蠟切片機(HM-325，德國LEICA公司)、PCR儀(3522，購于德國Eppendorf 公司)、全波長酶標儀(美國ThermoFisher Scientific公司)、電泳儀(DYY-11B，北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Image Gel Doc，購于美國Bio-Rad公司)。

1.4實驗方法

1.4.1兔佐劑性關節(jié)炎(AA)模型制備 20%烏拉坦靜脈按5 mg/kg的劑量注入麻醉動物，麻醉起效后，將0.5 ml FCA注入動物膝關節(jié)，14 d后再次注入FCA。3 w后察看兔子膝關節(jié)，若紅腫增粗則造模成功。

1.4.2種子細胞的誘導分化 從兔骨髓中穿刺抽取間充質(zhì)干細胞誘導分化為軟骨細胞，其過程包含分離純化、培養(yǎng)與誘導分化、鑒定等操作〔4〕，其主要步驟：兔骨髓液抽?。河?0%烏拉坦麻醉動物后，抽取膝關節(jié)骨髓液5 ml左右。自體骨髓間充質(zhì)干細胞的分離：用等量percoll淋巴細胞分離液與抽取的骨髓液混合，以2 000 r/min離心15 min，吸取8 ml培養(yǎng)液加入并充分混勻，1 200 r/min，離心5 min，棄上清液，重復一次，將percoll分離液洗去，移入培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。軟骨細胞的誘導：培養(yǎng)48 h后，骨髓間充質(zhì)干細胞呈梭形渦旋狀分布，細胞生長至80%～90%時，胰蛋白酶消化貼壁細胞并傳代培養(yǎng)。至P3代自體骨髓間充質(zhì)干細胞生長至培養(yǎng)瓶80%左右時，在常規(guī)培養(yǎng)液中加入約10%的誘導劑換液培養(yǎng)細胞，約2 w后自體骨髓間充質(zhì)干細胞絕大部分可誘導成軟骨細胞。軟骨細胞的鑒定：軟骨細胞多呈現(xiàn)星形、多角形。阿利新藍染色時細胞呈藍色即陽性。

1.4.3種子細胞與支架的混合 于24孔培養(yǎng)板中每孔加入400 μl的6%的海藻酸鈉凝膠與培養(yǎng)基的混合物，再加入1%CaCl2溶液20 μl，于15 min后吸取全部的CaCl2后加入細胞培養(yǎng)液。將支架與種子細胞懸液放入20 ml注射器內(nèi)，抽注射器讓細胞懸液與支架材料混勻后培養(yǎng)。

1.4.4支架復合物的治療 實驗動物耳緣靜脈麻醉后，A組、B組于關節(jié)腔內(nèi)注入0.5 ml生理鹽水；C組注入等量海藻酸鈉支架；D組注入等量軟骨細胞；E組注入等量支架復合軟骨細胞。

1.4.5兔膝關節(jié)滑膜蘇木素-伊紅(HE)染色 治療30 d后處死動物，取兔子膝關節(jié)，甲醛溶液固定后脫鈣，取材，經(jīng)過水洗、脫水透明、切片脫蠟、HE染色等操作，光學顯微鏡下觀察。

1.4.6ELISA檢測外周血細胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表達 用兔外周血3 ml離心后取上層液，按照試劑盒說明書用ELISA檢測外周血細胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表達。

1.5RT-PCR檢測Foxp3 mRNA和RORγt mRNA 的表達 使用Trizol法提取總RNA。用2 μl ddH2O調(diào)零，吸取2 μl RNA，測定RNA溶液260/280的比值和濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按說明書操作。RT-PCR使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計，合成，純化。RORγt mRNA引物：上游：5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′；下游：5′-GAGGAGCCTGTGGAGAAATAC-3′。Foxp3 mRNA引物：上游：5′-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3′；下游：5′-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3′。GAPDH：上游：5′-CCTCATGCCATCCTGCGTCT-3′；下游：5′-GCCACAAGGATTCCATACCCA-3′。PCR體系如下：cDNA 5 μl；上游引物(10 μmol/L)1 μl；下游引物(10 μmol/L)1 μl；2×TransTaq?HiFi PCR SuperMix25 μl；ddH2O 18 μl；總計50 μl。PCR條件：94℃ 30 s預變性；94℃ 5 s，60℃ 30 s，35個循環(huán)。最后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，Dunnett-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1AA模型制備結(jié)果 B組關節(jié)外觀紅腫，其內(nèi)可見增生現(xiàn)象和積液，并見乳白色軟骨。A組關節(jié)無紅腫，可見透明軟骨，未見增生現(xiàn)象。

2.2細胞的培養(yǎng)鑒定 間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)P3代成功后，加入誘導液使其分化成軟骨細胞，用阿利新藍染色，藍色顯示誘導成功。

2.3關節(jié)滑膜的HE染色結(jié)果 A組關節(jié)滑膜無異常，無炎細胞，B組炎細胞較多，C組、D組、E組較B組炎癥情況均有所改善。

2.4各組兔外周血中TGF-β1、IL-10、IL-22的ELISA檢測結(jié)果 與B組相比，A、E組兔外周血TGF-β1水平明顯多(P=0.002，P<0.007)，C組及D組TGF-β1差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組外周血IL-10、IL-22水平與B組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.5RT-PCR檢測各組兔滑膜中Foxp3 mRNA與RORγt mRNA的表達量水平比較 與B組相比，A組兔關節(jié)滑膜中Foxp3 mRNA的表達水平高(P<0.05)，RORγt mRNA表達水平明顯低(P<0.01)，C組和D組Foxp3 mRNA表達水平無差異(P>0.05)，E組Foxp3 mRNA表達水平高于B組(P<0.05)，C、D、E組RORγt mRNA表達水平明顯低于B組(P<0.05，P<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組免滑膜中Foxp3、RORγt mRNA表達比較

圖1 兔關節(jié)滑膜中Foxp3、RORγt mRNA電泳條帶

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細胞可通過改變生長環(huán)境誘導形成軟骨細胞，再與海藻酸鈉支架復合成組織工程化細胞，對佐劑性關節(jié)炎有明顯的抗炎療效〔4，5〕。海藻酸鈉支架不僅可以給軟骨細胞的增殖分化提供適宜的場所，而且與滑膜有較好的生物相容性，其降解產(chǎn)物無毒，是目前作為支架材料的完美選擇〔5～7〕。

目前一致認為RA和病人關節(jié)中的淋巴細胞及其分泌的多種炎癥因子聯(lián)系密切〔8〕。最近研究表明Th17/Treg和RA的發(fā)生密切相關，上述2種細胞對RA患者關節(jié)軟骨的破壞產(chǎn)生重大影響，已有研究表明〔9，10〕，Th17/Treg介導RA的免疫反應。初始T細胞可分化為Th17或Treg，Th17受RORγt mRNA調(diào)控，而低濃度的 TGF-β1和 IL-6 可共同誘導 RORγt 的表達。Th17可產(chǎn)生IL-17、IL-6、IL-22等，其中IL-17是主要的促炎效應因子，關節(jié)破壞與IL-17有關，并且IL-17還可通過活化滑膜細胞及上調(diào)造血因子的表達致使滑膜增生，加重RA的發(fā)生發(fā)展〔11，12〕。Treg可增加機體的自身耐受且保持對炎癥因子的免疫無反應性〔13〕。本研究結(jié)果提示海藻酸鈉支架或工程化軟骨細胞均有一定的抗炎作用。支架復合軟骨細胞可提高關節(jié)滑膜Foxp3 mRNA表達水平降低RORγt mRNA表達水平從而起到抗炎作用。

TGF-β1是影響初始T細胞向Th17/Treg的分化的主要因素。TGF-β1低表達可與IL-6共表達增加Th17的分化，TGF-β1高濃度增加Treg的分化〔14〕。本研究結(jié)果提示TGF-β1可能通過影響RORγt mRNA、Foxp3 mRNA進而影響初始T細胞的分化方向來影響各組RA的發(fā)生發(fā)展。

IL-10是T細胞和APC的抑制因子，能夠改善RA滑膜炎癥情況，下調(diào)破骨細胞的激活，也可減輕關節(jié)腫脹程度，改善軟骨損壞情況。但也有研究表明IL-10可增加成熟B細胞數(shù)量并阻止B細胞凋亡從而達到致炎作用。目前有研究表明〔15～17〕關于RA患者血清中IL-10的檢測結(jié)果不一致，表達量有升高也有降低的。本研究結(jié)果顯示，與B組相比，各組血清中IL-10的表達量無變化。造成此現(xiàn)象的原因可能有實驗動物是兔，與RA患者存在表達上的區(qū)別，其次IL-10主要表面在滑膜細胞膜上或存在于滑液中，而關節(jié)的營養(yǎng)供應不足，較小范圍的炎癥反應未能觸發(fā)機體的免疫調(diào)節(jié)功能，本實驗檢測的是血清中的IL-10。關于RA患者中外周血IL-10與RA的關系需要更多實驗加以驗證研究。

IL-22由Th1、Th17、Th22等細胞產(chǎn)生，在RA進程中起重要作用。IL-22與骨破壞X線分期呈正向關聯(lián)(P<0.05)，是骨破壞的危險因素，可用于評價RA的病情〔18〕。對RA患者外周血IL-22檢測結(jié)果顯示，RA組IL-22濃度高于對照組(P<0.05)〔19〕；RA患者滑膜組織檢測結(jié)果顯示，與健康人相比，IL-22 mRNA的表達水平增加，IL-22受體的轉(zhuǎn)錄水平也隨之增加〔20〕。本研究結(jié)果與以往研究不同的原因可能是機體是一個協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體，一個免疫反應發(fā)生，其對應的免疫調(diào)節(jié)也應激產(chǎn)生，使機體維持在一定的平衡之中?；ぱ装Y的產(chǎn)生使機體中抑炎因子也會相應分泌，而局部炎癥未能引發(fā)全身免疫調(diào)節(jié)反應，因此血清中IL-22可能無明顯變化。