李云飛 劉代順 劉振峰

(1遵義市第一人民醫(yī)院呼吸科，貴州 遵義 563000;2遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

凋亡逃逸在惡性腫瘤形成中起關(guān)鍵作用，其中XIAP屬于凋亡抑制蛋白(AP)家族中的成員，被認(rèn)為是家族凋亡抑制作用最強(qiáng)的蛋白之一。XIAP可有效抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)，包括Caspase-9和Caspase-3等，從而起到抑制腫瘤凋亡作用〔1〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)與XIAP和Caspase-9基因的關(guān)聯(lián)性報道較少，本文使用免疫組化和轉(zhuǎn)染技術(shù)分析兩種基因在NSCLC中的表達(dá)情況，并觀察正常組織中與NSCLC患者組織中兩種基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析，研究XIAP和Caspase-9基因與NSCLC發(fā)展和發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年5月至2014年5月于遵義市第一人民醫(yī)院行NSCLC手術(shù)切除患者標(biāo)本56例，其中鱗癌12例、支氣管肺泡癌23例及腺癌21例，上述患者均經(jīng)病理確證；選取同期24例經(jīng)手術(shù)切除距病灶>5 cm處肺組織者作為對照，組織取出后放入液氮進(jìn)行冷凍，并放于-80℃冰箱中保存；24例對照患者男15例，女9例，年齡34～73歲，平均年齡(42.3±8.9)歲，上述納入者術(shù)前均未行NSCLC相關(guān)治療；患者或家屬均已簽署知情同意書。

1.2主要試劑 兔來源XIAP多克隆抗體購于美國thermo 公司(編號：PA126426)；兔來源的多克隆抗體Caspase-9購于美國abcam公司(編號：Ab137392)；羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶(HRP)多聚體的二抗購于中國碧云天；免疫組化檢測試劑盒EnVisionTM Two-Step購于丹麥DAKO公司(批號：1701777A)。病毒DNA抽提試劑盒購于Invitrogen公司(批號:1681569A)。

1.3免疫組化 根據(jù)免疫組化試劑盒步驟進(jìn)行組織石蠟切片，二甲苯脫蠟10 min×2次，無水乙醇3 min×2次、95%乙醇2 min×2次、70%和80%乙醇分化2 min，經(jīng)自然水化后行蒸餾水洗。抗原修復(fù)使用pH6.0高溫高壓抗原修復(fù)；時間是在冒氣后計時100 s，然后流水沖洗至室溫，蒸餾水洗后行磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次，內(nèi)源性過氧化物經(jīng)3%過氧化氫(H2O2)水溶液阻斷10 min后給予PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗，放于37℃下進(jìn)行孵育60 min。對照使用PBS替代一抗并行PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體二抗，放于37℃下進(jìn)行孵育40 min，PBS沖洗5 min×3次，經(jīng)二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1 min，并放于顯微鏡下觀察反應(yīng)狀態(tài)，使用純凈水沖洗終止反應(yīng)；Harris蘇木素液對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染1 min，并使用100%和95%的乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組織化學(xué)陽性為黃色或黃棕色，細(xì)胞核襯染呈藍(lán)色。Caspase-9和XIAP表達(dá)情況：兩種基因均存在于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)或胞質(zhì)中，Caspase-9壞死凋亡區(qū)陽性降低，而XIAP基因則表現(xiàn)為陽性增加；陽性判斷：上述兩種基因均使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測量，于顯微鏡下選取病死灶周邊區(qū)域3～5個染色陽性并拍照記錄，并應(yīng)用積分光密度(IOD)測量陽性細(xì)胞的強(qiáng)弱。將納入的鱗癌、腺癌和支氣管肺泡患者切除的組織和正常組織通過上述試驗(yàn)方法檢測Caspase-9的表達(dá)。

1.4構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒 傳代293T細(xì)胞：每個T75瓶加2 ml明膠，24孔板每個孔加3滴明膠，于37℃培養(yǎng)箱放置15 min以上。

將培養(yǎng)的細(xì)胞放入培養(yǎng)基中進(jìn)行抽吸，吸凈后加入0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)液2 ml，均勻覆蓋瓶底后放于37℃下保溫箱中培養(yǎng)2 min后取出，加入3 ml 37℃水浴中預(yù)熱的完全培養(yǎng)基終止，吹打6～8次。將瓶中細(xì)胞吸出并放于15 ml離心管中，同時取50 μl細(xì)胞液放于EP管中，并加入450 μl培養(yǎng)基進(jìn)行10倍稀釋。鋪細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量為1 000萬/T75瓶，350萬/T25瓶，24孔板則30萬/孔，最后加新鮮培養(yǎng)液至總體積為10 ml/T75瓶； 4 ml/T25瓶；0.5 ml/24孔板每孔。第2天轉(zhuǎn)染前觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度匯合>80%則可繼續(xù)轉(zhuǎn)染；預(yù)備37℃水將I減血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)放入預(yù)熱，脂類(Fugene)轉(zhuǎn)染劑需再正常室溫下才可有效。將預(yù)熱后的Opti-MEM加入微量離心管中，并依次加入質(zhì)粒，吹打5～6次后加入Fugen轉(zhuǎn)染劑。Fugene轉(zhuǎn)染試劑需加至Opti-MEM液面之下，立即充分混勻，瞬時離心后室溫放置18 min，即可加入培養(yǎng)瓶中，晃勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔2～4 h晃勻一次。轉(zhuǎn)染后12～24 h(次日)，觀察熒光情況并更換培養(yǎng)基；T25和T75瓶中分別裝入4 ml和12 ml；換液時間為48 h后，換液后T25和T75瓶中液分別為3 ml和8 ml；24孔板中每孔為0.5 ml。收集轉(zhuǎn)染后48 h和72 h病毒，并進(jìn)行離心5 min取出細(xì)胞碎片，放于4℃保溫箱中保存(保存時間不超過1 w)。24孔板滴度使用懸浮轉(zhuǎn)染進(jìn)行測定，先用明膠包被24孔板15 min(每孔200 μl)； 消化293T，24孔板每孔鋪15萬細(xì)胞?？蓪⒓?xì)胞混勻，體積擴(kuò)大15萬細(xì)胞/500 μl，加入1 000×的聚凝胺(終濃度10 μg/ml)混勻，每孔加入500 μl即可；設(shè)兩個感染梯度，分別取2 μl和5 μl病毒液加入24孔板的一孔中，搖勻后放入培養(yǎng)箱，48 h后即可觀察其熒光，計算滴度。48 h后15萬細(xì)胞可達(dá)到完全匯合狀態(tài)，同時計算病毒滴度。加入4%多聚甲醛(PFA)固定30 min，24孔板每孔200 μl； 用0.1%聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)洗2次，每次5 min； 用PBS將4，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(DAPI)稀釋1 000倍，每孔加入200 μl，避光室溫靜置5 min。在熒光顯微鏡下計數(shù)。病毒滴度(IU/ml)=熒光細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比÷加入的病毒上清體積(μl)×1.5×105×103。超速離心27 000 r/min,90 min,4℃。用PBS重新溶解病毒顆粒(需在4℃放置超過24 h才能溶解)。病毒濃縮： 收集48 h上清，4 ml/T25瓶，放置4度，收集72 h上清，4 ml/T25瓶。4 000 r/min，4℃離心5 min，去碎片。加入5×的病毒濃縮液，混勻，4℃放置>12 h。4℃離心，1 500g，30 min，上清再次離心，1 500 r/min，5 min。分別加200 μl慢病毒溶解液(MEM)溶解。將納入的鱗癌、腺癌和支氣管肺泡患者切除的組織和正常組織通過上述試驗(yàn)方法檢測XIAP的表達(dá)。

1.5病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后顯微鏡下觀察XIAP、Caspase-9染色 建立穩(wěn)轉(zhuǎn)XIAP、Caspase-9基因的肺癌細(xì)胞株 用293T細(xì)胞包裝出EFRT慢病毒(LV-EFRT)，濃縮后感染NCI-H460肺癌細(xì)胞株，用玻璃微管挑出有紅熒光的克隆，克隆經(jīng)單細(xì)胞傳代，長出的克隆再次用玻璃微管挑出有紅熒光的克隆進(jìn)行純化，純化的細(xì)胞擴(kuò)增得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1XIAP基因在正常組織和NSCLC組織中的表達(dá) NSCLC組織中XIPA表達(dá)明顯高于正常組織，顯示XIAP在胞質(zhì)中呈黃棕色或黃色，藍(lán)色為細(xì)胞核；NSCLC組織中的XIAP表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.05)，且上述3種NSCLC切除組織中的XIAP基因表達(dá)情況均高于正常組織。見表1，圖1。

2.2正常肺組織和NSCLC組織中Caspase-9的表達(dá) 正常肺組織中的Caspase-9的表達(dá)明顯高于NSCLC組織，且此基因主要表達(dá)為細(xì)胞核和胞質(zhì)中，呈黃棕色和黃色等；正常肺組織中Caspase-9表達(dá)顯著高于NSCLC組織(P<0.05)，且上述3種正常肺組織中的Caspase-9基因表達(dá)情況均高于NSCLC組織。見表1、圖2。

表1 各組XIAP、Caspase-9表達(dá)比較

圖1 正常肺組織XIAP表達(dá)低于NSCLC組織(×200)

圖2 正常肺組織中的Caspase-9表達(dá)明顯高于NSCLC組織(×200)

2.3病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后顯微鏡下觀察XIAP、Caspase-9染色 病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后顯微鏡下觀察，用BamHI和SalI對質(zhì)粒XIAP進(jìn)行雙酶切，回收片段中紅色熒光代表轉(zhuǎn)染成功。用BamHI和SalI對質(zhì)粒Caspase-9進(jìn)行雙酶切，回收片段2，紅色熒光代表轉(zhuǎn)染成功。見圖3。

圖3 病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后顯微鏡下觀察XIAP、Caspase-9染色(×100)

3 討 論

肺癌是如今在臨床上常見的具有較高死亡率的惡性腫瘤疾病之一，而該類腫瘤患者中大約80%以上均屬于NSCLC〔2，3〕。大量臨床經(jīng)驗(yàn)及研究表明，當(dāng)NSCLC處于晚期階段時其治愈的概率較小，而處于Ⅰ期的NSCLC通過徹底的手術(shù)根除治療后生存時間超過5年的患者比例可達(dá)到60%～80%。因此對NSCLC的及早正確診斷是保證其治療及預(yù)后效果的主要因素之一。肺癌發(fā)病率每年呈顯著性升高，且我國肺癌人群5年生存率僅為19.7%。影像學(xué)在臨床中診斷肺癌占據(jù)重要地位，但影像學(xué)診斷在發(fā)現(xiàn)病變和定性中存在局限性。據(jù)不完全統(tǒng)計〔4〕，全國近50年以來肺癌患者已逐漸超過胃癌與肝癌，肺癌已成為現(xiàn)今病發(fā)病死高峰時代，也逐漸變成腫瘤當(dāng)中第一位。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)〔5〕顯示，惡性腫瘤男性發(fā)病率及死亡率超過女性發(fā)病率及死亡率。臨床數(shù)據(jù)〔6，7〕顯示，肺癌中，NSCLC占85%，患者生存率5年內(nèi)僅為15%。小細(xì)胞肺癌患者2年內(nèi)僅為1%的生存率。相關(guān)〔8〕顯示，部分患者經(jīng)醫(yī)院確診后腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)開始逐漸轉(zhuǎn)移及腫瘤局部晚期(Ⅲb/Ⅳ期)，晚期患者與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者已失去最佳手術(shù)治療時間。臨床肺癌患者癥狀不明顯及影像檢查呈現(xiàn)陰性時，患者血清腫瘤標(biāo)志物會逐漸升高，當(dāng)腫瘤標(biāo)志物升高時檢測，將提高肺癌診斷率。有研究〔9〕發(fā)現(xiàn)XIPA基因表達(dá)與急性白血病患者的死亡存在明顯關(guān)聯(lián)，且證實(shí)XIAP基因表達(dá)水平高者存活率明顯低于XIAP水平低者。腫瘤患者在化療或治療過程中XIAP均表現(xiàn)為不同程度升高。NSCLC中使用低劑量照射可造成XIAP表達(dá)升高，并可誘發(fā)放射凋亡抵抗。相關(guān)研究〔10〕用XIAP腺病毒感染卵巢上皮性細(xì)胞癌，證明XIAP在卵巢上皮性癌系中具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常肺組織中XIAP表達(dá)明顯低于NSCLC組織，與具體那種類型NSCLC無關(guān)，可能與疾病早期診斷、治療及預(yù)后的關(guān)系存在一定的關(guān)系。Caspase屬于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族的成員。有研究〔11〕發(fā)現(xiàn)Caspase參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，且在自身免疫性疾病和腫瘤中表現(xiàn)尤為顯著。Caspase-9基因定位于1p36.3～p36.1，編碼的蛋白產(chǎn)物分子量約為46 000 D，廣泛表達(dá)于人類的正常組織，如神經(jīng)組織、肌肉組織、肝臟、脾臟和肺等〔12〕，目前在肺癌國內(nèi)較少研究其蛋白水平的表達(dá)研究〔13〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中的Caspase-9蛋白表達(dá)較正常肺組織的明顯下調(diào)與轉(zhuǎn)染結(jié)果一致，提示凋亡基因Caspase-9蛋白減低與NSCLC的發(fā)生相關(guān)，證明了在NSCLC患者中XIAP在凋亡通路中通過抑制其核心蛋白Caspase的作用。有學(xué)者〔14〕提出Caspase-9可能與疾病早期診斷、治療及預(yù)后存在一定的關(guān)系。而是否同時檢測2種蛋白會增加特異性及敏感性仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，XIAP和Caspase-9與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；XIAP和Caspase-9在NSCLC組織之間有統(tǒng)計學(xué)意義，預(yù)示著可能與和NSCLC的早期診斷與預(yù)后可能有關(guān)，可能為NSCLC治療提供新的治療靶點(diǎn)。