賀曉靜 李白煜 賀潔 (開(kāi)封大學(xué)，河南 開(kāi)封 475000；河南大學(xué))

每年新發(fā)肝癌診出約854萬(wàn)例，成為全球第六大常見(jiàn)癌癥〔1〕。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)，美國(guó)肝癌的發(fā)病率在所有癌癥中增長(zhǎng)最快，可能是由于肥胖/糖尿病的增多導(dǎo)致的〔2〕。由于缺乏有效的治療，肝癌是導(dǎo)致成年男性癌癥死亡的第二大原因。激活宿主免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生顯著抗腫瘤效果〔3〕。雖然這是很有前景的治療方法，但程序性死亡受體(PD)-1阻斷的抗腫瘤效果取決于腫瘤特異性浸潤(rùn)性T細(xì)胞的存在。除此之外，通過(guò)免疫檢查點(diǎn)釋放非特異性免疫可能導(dǎo)致自身免疫破壞。但靶向腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的免疫療法很少引起自身免疫疾病〔4〕。研究已經(jīng)鑒定過(guò)肝癌高表達(dá)抗原黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)C2有效的人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A2限制性CD8+細(xì)胞素性T細(xì)胞(CTL)表位〔5〕，然而，尚不清楚MAGEC2衍生的表位是否能夠引發(fā)體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答。在荷瘤小鼠模型中用表位肽P356-1Y2L能引起強(qiáng)烈的抗腫瘤反應(yīng)，可能有助于MAGEC2衍生的表位在抗腫瘤免疫療法中的應(yīng)用〔6〕。本文擬檢測(cè)MAGEC2衍生的免疫原性肽在小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫效果。

1 材料和方法

1.1材料 T2A2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞(MAGEC2+、HLA-A2+)、H22細(xì)胞由開(kāi)封大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。6～8周齡Balb/c和昆明小鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。表位肽P248-1Y、P356-1Y2L由上海科肽生物科技有限公司合成。青霉素和鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco，Anti-CD8 抗體和Anti-干擾素(IFN)-γ抗體均購(gòu)自美國(guó)的eBioscience品牌。鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2抗腫瘤保護(hù)模型 選取6～8周齡Balb/c小鼠，每組5只，每間隔10 d(即第0、10和20天)腹腔注射免疫小鼠，每只小鼠由100 μg/ml的肽和不完全弗氏佐劑(IFA)(Sigma-Aldrich，USA)按1∶1乳化。對(duì)照組用磷酸鹽緩沖液(PBS)和同體積IFA進(jìn)行乳化。為了分析誘導(dǎo)特異性CTL，在最后1次免疫后10 d(即第30天)，處死小鼠并將脾細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入10 μg的肽。2 d后做為效應(yīng)細(xì)胞鋪于96孔板中，以效靶比50.0∶1，25.0∶1和12.5∶1的比例加入靶細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)，LDH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)。在37°C孵育4 h，孵育結(jié)束前45 min，將10 μl裂解物加入靶細(xì)胞最大釋放組。離心4 min后，將50 μl上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔板中，每個(gè)孔中加入50 μl底物混合物，黑暗中室溫孵育30 min；每孔分別加入50 μl終止液。用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)490 nm處的OD值。計(jì)算公式：殺傷率=(實(shí)驗(yàn)孔值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值-CTL自發(fā)釋放值)/(靶細(xì)胞值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值)×100%〔7〕。

1.3胞內(nèi)因子染色 收獲上述效應(yīng)細(xì)胞，加入終濃度為10 μg/ml的布雷菲德菌素(BFA)，并在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2中孵育6 h。培養(yǎng)完成后，用4%多聚甲醛在4℃下固定20 min，在室溫下用0.1%皂苷處理10 min，并用PBS洗滌。加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠CD8抗體(1∶200稀釋)，PE標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ流動(dòng)單克隆抗體，在4℃下黑暗中孵育30 min，通過(guò)離心棄去上清液，將細(xì)胞重懸于PBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)〔8〕。

1.4檢測(cè)IFN-γ分泌水平 取出ELISPOT條帶，加入200 μl無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min；誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，T2A2荷肽作為刺激細(xì)胞。根據(jù)ELISPOT實(shí)驗(yàn)技術(shù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行常規(guī)操作。最后將條帶置于通風(fēng)處，在室溫下進(jìn)行干燥；使用ELISPOT圖像分析儀計(jì)數(shù)96孔板的斑點(diǎn)數(shù)〔9〕。

1.5治療模式 H22細(xì)胞接種于昆明小鼠腹腔，6～8 d可產(chǎn)生腹水，通過(guò)腹水進(jìn)行傳代。1 w后抽取腹水常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。調(diào)整至1×107個(gè)細(xì)胞/ml。細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底70%～80%時(shí)既是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。常規(guī)消毒后，在第0天將H22細(xì)胞皮下注射到小鼠的背部。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)度和寬度約為0.5 cm，在第12天腹腔內(nèi)注射100 μg/ml乳化后的表位肽。每隔4天免疫1次，出現(xiàn)第1個(gè)腫瘤時(shí)及時(shí)進(jìn)行測(cè)量，游標(biāo)卡尺每2天測(cè)1次，腫瘤體積=0.4×(長(zhǎng)度×寬度)2。在31 d的時(shí)間里觀察小鼠的存活情況〔10〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ELISPOT檢測(cè)多肽免疫BALB/c小鼠分泌的IFN-γ P248-1Y組和P356-1Y2L組分泌的斑點(diǎn)數(shù)分別為(64.6±11.5)個(gè)和(245.4±109.2)個(gè)，顯著高于PBS組的斑點(diǎn)數(shù)〔(13.0±4.4)個(gè)，P<0.05〕。見(jiàn)圖1。

圖1 候選肽在Balb/c小鼠體內(nèi)特異性CTL分泌IFN-γ能力的檢測(cè)

2.2GLMEEMSAL肽免疫能在BALB/c小鼠中特異性激活T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞 P356-1Y2L肽刺激的CD8+T淋巴細(xì)胞能夠裂解靶細(xì)胞，而用P248-1Y肽和PBS刺激的脾細(xì)胞顯示出較低的裂解活性。同時(shí)，對(duì)靶細(xì)胞HepG2+BB7.2未顯示出殺傷活性。說(shuō)明了P248-1Y和P356-1Y2L誘導(dǎo)的特異性CTL殺傷靶細(xì)胞具有HLA-A2限制性。見(jiàn)表1。

表1 表位肽免疫BALB/c小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性

2.3胞內(nèi)因子染色檢測(cè)多肽免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)CTL的能力 P248-1Y和P356-1Y2L組CD8+T細(xì)胞能分泌IFN-γ水平分別為(1.84±0.22)%、(3.56±0.25)%，顯著高于PBS表位組〔(0.78±0.16)%,P<0.05〕。見(jiàn)圖2。

圖2 胞內(nèi)因子染色檢測(cè)表位肽體內(nèi)誘導(dǎo)CTL分泌IFN-γ的能力

2.4P356-1Y2L肽免疫抑制BALB/c小鼠腫瘤生長(zhǎng) 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，P356-1Y2L組與PBS相比，腫瘤生長(zhǎng)減少高達(dá)40%。見(jiàn)圖3。

2.5表位肽P356-1Y2L提高了荷瘤小鼠的生存期 與表位肽可以抑制BALB/c小鼠腫瘤生長(zhǎng)一樣，表位肽亦可提高荷瘤小鼠的生存期。相對(duì)于PBS組接受表位肽P356-1Y2L的免疫荷瘤小鼠的存活率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 BALB/c小鼠腫瘤模型中表位肽的抗腫瘤作用

圖4 多肽免疫可增強(qiáng)荷瘤小鼠生存期

3 討 論

肝癌的發(fā)生發(fā)展是從患者患有慢性炎癥或肝硬化的非癌性肝病變逐漸發(fā)展成肝癌的，并且這些病變不能通過(guò)藥物治療來(lái)治愈或根除〔11〕。通過(guò)預(yù)防非癌性肝臟病變進(jìn)展為肝癌及減輕腫瘤負(fù)擔(dān)，免疫療法可有效用于肝癌治療并且預(yù)防疾病的發(fā)展〔4〕。然而，腫瘤免疫在腫瘤部位經(jīng)常被抑制，特別是在易于表現(xiàn)出免疫耐受的肝臟微環(huán)境中，通過(guò)門靜脈對(duì)已暴露的抗原減少異常免疫應(yīng)答。目前，癌癥免疫療法采用兩種不同的策略，增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞功能和釋放免疫抑制性腫瘤微環(huán)境〔12〕。

人們普遍認(rèn)為，多肽具有許多非常有吸引力的優(yōu)點(diǎn)，包括有利的藥代動(dòng)力學(xué)特征和組織分布模式，血液的快速清除，低毒性和免疫原性及具有良好的溶解性〔13〕。鑒定和開(kāi)發(fā)具有抗腫瘤特性的新型生物活性肽，為癌癥的預(yù)防和治療提供了良好的機(jī)會(huì)〔14〕。目前，多肽的從頭設(shè)計(jì)和合成是抗腫瘤肽的主要來(lái)源形式，可以通過(guò)抑制腫瘤血管生成發(fā)揮有效的抗腫瘤活性。隨著對(duì)癌癥中涉及的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用的進(jìn)一步研究，將發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多可以特異性結(jié)合這些蛋白質(zhì)的多肽〔15〕。在癌癥治療過(guò)程中，抗腫瘤肽面臨著許多的治療挑戰(zhàn)，包括穩(wěn)定性差、膜通透性低和容易被蛋白酶水解消化〔16〕。為了解決這些問(wèn)題，已經(jīng)廣泛采用了3種不同類型的修飾策略，包括氨基酸取代，功能肽的結(jié)構(gòu)融合和與化學(xué)治療藥物的綴合，并且已被證明在體內(nèi)外活性實(shí)驗(yàn)中是有效的〔17〕。

基于T細(xì)胞的特異性免疫療法被認(rèn)為是最有希望的腫瘤治療策略之一。CTL能夠識(shí)別源自主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類分子上呈遞的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽，隨后對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行裂解。人體中有效的腫瘤免疫是與針對(duì)腫瘤抗原CTL的存在有關(guān)，腫瘤抗原是一類源自腫瘤特異性抗原或TAA的HLA結(jié)合肽〔18〕。由于大多數(shù)TAA是自身抗原，在癌癥患者中，靶向腫瘤相關(guān)自身抗原的特異性CTL由于胸腺耗竭而不常見(jiàn)，并且在產(chǎn)生抗體免疫應(yīng)答方面效果不佳。所以需要用特殊的手段去提高表位肽的免疫原性〔19〕。此外，在臨床研究中，已經(jīng)有增強(qiáng)表位的免疫原性去誘導(dǎo)特異性的CTLs令人鼓舞的結(jié)果〔20～23〕。在實(shí)驗(yàn)中本文觀察到用肽P356-1Y2L免疫BALB/c能夠誘導(dǎo)識(shí)別和裂解腫瘤細(xì)胞CTL的活化。此外，本研究表明在體內(nèi)使用MAGEC2衍生的表位提供抗腫瘤免疫治療方案，可抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠的生存期。

在基于肽的免疫療法的臨床試驗(yàn)中，已經(jīng)證明腫瘤抗原衍生的肽可以成功地誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的抗原特異性CTL〔24〕。本研究證明了對(duì)HLA-A2+具有高親和力的MAGEC2衍生表位P356-1Y2L可誘導(dǎo)BALB/c小鼠中的抗腫瘤CTL反應(yīng)。