郝啟萌 紀(jì)兆樂(lè) 任 何 王 彬 張 薇 汪 潔

（空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710000）

動(dòng)脈粥樣硬化以脂質(zhì)代謝障礙為病變基礎(chǔ)，是多種心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，對(duì)其機(jī)制的探究是防治心血管疾病的關(guān)鍵[3-5]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究指出，動(dòng)脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等促炎癥細(xì)胞密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞進(jìn)一步聚集形成壞死核心，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[8-9]。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除大鼠纖維斑塊的形成與人類(lèi)極其相似，可模擬人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化病理表現(xiàn)[10]。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase-inducible factor，EMMPRIN）是一種能夠影響基質(zhì)金屬蛋白酶家族表達(dá)水平的生物因子，臨床研究指出該因子會(huì)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。尿激酶型纖溶液原激活物（μPA）是纖溶酶原的重要組成部分，臨床研究指出該因子具有一定加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)程的作用[11-12]。本研究探討EMMPRIN 及μPA 在ApoE 敲除大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展過(guò)程中的表達(dá)水平變化以及兩者之間的相關(guān)性，以期明確 EMMPRIN 和μPA 與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和進(jìn)展的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取8 周齡的ApoE 基因敲除雄性大鼠80 只（購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心），按照隨機(jī)數(shù)字表法將其均分為高脂飲食組與對(duì)照組（每組各40 只大鼠），高脂飲食組大鼠體質(zhì)量320～351 g，平均體質(zhì)量（336.23±12.03）g，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量321～349 g，平均體質(zhì)量（335.29±12.11）g，2組大鼠一般資料差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 干預(yù)方法

2 組大鼠均飼養(yǎng)于常規(guī)環(huán)境下，高脂飲食組給予高脂飲食（普通大鼠飼料+21%豬油+0.15%膽固醇）喂養(yǎng)，對(duì)照組大鼠予以正常飲食喂養(yǎng)，2 組大鼠喂養(yǎng)時(shí)間均為18 周，并分別于喂養(yǎng)第6、10、14、18 周時(shí)處死10 只大鼠，取主動(dòng)脈弓浸于4%多聚甲醛，備做H-E 染色；同時(shí)取主動(dòng)脈至腹主動(dòng)脈血管-70℃保存，備做免疫印跡和RT-PCR 檢測(cè)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

行主動(dòng)脈石蠟切片，觀察喂養(yǎng)不同時(shí)間主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)。主動(dòng)脈標(biāo)本研磨后采用光密度比值法檢測(cè)EMMPRIN 及μPA 的mRNA 表達(dá)，采用蛋白提取和免疫印跡分析EMMPRIN 及μPA 蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS16.0 對(duì)采集的數(shù)據(jù)實(shí)施分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病理學(xué)變化

檢測(cè)分析顯示，喂養(yǎng)至6 周時(shí)，對(duì)照組及高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈均無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，高脂飲食組可見(jiàn)極少量的脂質(zhì)條紋形成；喂養(yǎng)10 周時(shí)，對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，但高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，且出現(xiàn)明顯增厚的內(nèi)膜、中膜，并發(fā)少量的纖維帽；喂養(yǎng)至18 周時(shí)，對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見(jiàn)少量動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，而高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)明顯的混合斑塊，脂質(zhì)沉積明顯，纖維帽變薄，斑塊的穩(wěn)定性進(jìn)一步下降。

2.2 主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN 和μPA 表達(dá)情況

經(jīng)檢測(cè)對(duì)比顯示，喂養(yǎng)第6、10、14、18 周時(shí)高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN 和μPA 的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 2 組大鼠不同時(shí)間主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN 和μPA 蛋白及mRNA 表達(dá)水平對(duì)比（±s）Tab 1 Comparison of EMMPRIN and μPA protein and mRNA expression levels in the aorta between the two groups at different time points（±s）

表1 2 組大鼠不同時(shí)間主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN 和μPA 蛋白及mRNA 表達(dá)水平對(duì)比（±s）Tab 1 Comparison of EMMPRIN and μPA protein and mRNA expression levels in the aorta between the two groups at different time points（±s）

*P＜0.05 vs control

Group Observation time point EMMPRIN μPA EMMPRIN mRNA μPA mRNA Control 6th week 0.061±0.012 0.403±0.012 0.106±0.011 0.026±0.003 10th week 0.236±0.015 0.613±0.012 0.173±0.023 0.156±0.021 14th week 0.269±0.014 0.698±0.021 0.216±0.051 0.268±0.015 18th week 0.276±0.013 0.763±0.151 0.256±0.020 0.369±0.011 High fat diet 6th week 0.421±0.032* 0.701±0.021* 0.336±0.051* 0.426±0.065*10th week 0.498±0.026* 0.769±0.023* 0.462±0.036* 0.536±0.012*14th week 0.733±0.021* 0.823±0.016* 0.513±0.041* 0.869±0.015*18th week 0.889±0.032* 1.035±0.032* 0.956±0.036* 1.326±0.015*

2.3 主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN 和μPA mRNA 表達(dá)情況

經(jīng)檢測(cè)對(duì)比顯示（表1），喂養(yǎng)第6、10、14、18 周時(shí)高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN 和μPA的mRNA 表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。分析兩者表達(dá)水平相關(guān)性，顯示EMMPRIN 與μPA 表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.635，P＜0.05）（表1）。

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)研指出，目前心血管疾病已成為死亡率最高的疾病之一，2004年全球約有1 710 萬(wàn)人死于心血管疾病，死亡率約占全部疾病的29%，其中死于冠心病人數(shù)達(dá)720 萬(wàn)人，死于卒中人數(shù)達(dá)570 萬(wàn)人。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2030年，全球會(huì)有近2 360 萬(wàn)人死于心血管相關(guān)疾病。近些年隨著我國(guó)人民生活水平的提升和人口老齡化趨勢(shì)的顯現(xiàn)，各類(lèi)心血管相關(guān)疾病的發(fā)病率及死亡率也有逐年遞增趨勢(shì)[13-15]。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其病變受個(gè)體體質(zhì)、后天環(huán)境等多種因素的影響[16]。動(dòng)脈粥樣硬化的本質(zhì)是一類(lèi)在大、中型動(dòng)脈部位發(fā)生的，以大量脂質(zhì)和膽固醇聚集生成纖維斑塊為特征的慢性炎癥性疾病。當(dāng)前的臨床研究指出，炎性反應(yīng)、膽固醇代謝異常、巨噬細(xì)胞泡沫化、脂質(zhì)代謝障礙等都與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)[17]，臨床研究也多從上述方向出發(fā)，探究干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的方式方法。

EMMPRIN 是一種分子量約為58 kD 的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的一員，其主要功能為參與細(xì)胞與細(xì)胞間的識(shí)別、細(xì)胞-基質(zhì)的黏附，同時(shí)還在誘導(dǎo)和調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） 表達(dá)中也發(fā)揮重要作用。而MMP 在平滑肌、巨噬細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)態(tài)，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用。李鳳等[18]通過(guò)研究指出，MMP 基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死具有密切聯(lián)系，MMP 多態(tài)性是腦梗死復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，MMP 的過(guò)度表達(dá)會(huì)增加細(xì)胞外基質(zhì)降解，造成血腦屏障開(kāi)放和血管通透性增加，誘發(fā)血管源性腦水腫。張鋒等[19]的研究也指出，MMP-8 能夠通過(guò)降解膠原蛋白及其他活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和干細(xì)胞的功能，加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展，增加斑塊的不穩(wěn)定性，同時(shí)MMP 還與冠心病的發(fā)生及預(yù)后具有密切聯(lián)系。μPA 是纖溶酶原系統(tǒng)的重要組成部分，具有一定的促動(dòng)脈粥樣硬化作用。楊麗霞等[20]的研究則指出，μPA 會(huì)降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，加重冠心病患者病情。

本研究結(jié)果顯示，相比于正常飲食的ApoE 敲除大鼠，實(shí)施高脂飲食的大鼠干預(yù)18 周后動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成更為明顯，斑塊穩(wěn)定性更差。進(jìn)一步分析顯示，相比于對(duì)照組大鼠，高脂飲食組大鼠的EMMPRIN 與μPA 蛋白呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)態(tài)，EMMPRIN 與μPA mRNA 表達(dá)也明顯高于對(duì)照組大鼠。這與楊麗霞等[20]的研究結(jié)果相一致，該學(xué)者通過(guò)對(duì)冠心病患者實(shí)施對(duì)比分析表明，軟斑塊患者EMMPRIN 與μPA 蛋白水平明顯要高于纖維斑塊和鈣化斑塊患者。筆者分析認(rèn)為，EMMPRIN是MMP 的上游調(diào)控因子，最早于腫瘤細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)，該蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞中具有誘導(dǎo)MMP 產(chǎn)生的效果，而上文提到MMP 的過(guò)量表達(dá)不僅會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生損害，加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，同時(shí)還會(huì)加速斑塊纖維帽溶解，降低斑塊的穩(wěn)定性，本研究高脂飲食組大鼠喂養(yǎng)18 周時(shí)主動(dòng)脈斑塊纖維帽變薄就證實(shí)了該觀點(diǎn)。也有較多的研究指出μPA 在動(dòng)脈壁局部具有促使基質(zhì)降解、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移增殖及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)等作用。田祥全等[21]報(bào)道，μPA 具有致動(dòng)脈粥樣硬化作用，能夠通過(guò)激活纖溶酶原，使纖溶酶生成增多，影響血栓的形成，進(jìn)而加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。本研究結(jié)果也證實(shí)，μPA 的高表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程具有密切的相關(guān)性，隨著μPA 蛋白表達(dá)的升高，大鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊也呈現(xiàn)明顯加重趨向。

總之，EMMPRIN 與μPA 在ApoE 敲除大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中隨著斑塊病情的加重而表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)升高，同時(shí)EMMPRIN 及μPA 表達(dá)呈正相關(guān)，表明兩者可能參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成且發(fā)揮促進(jìn)作用。