秦紅霞，張?zhí)梗航?/p>

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔科，河南 鄭州 450000)

牙周炎的發(fā)展伴隨著牙周支持組織的破壞，可造成牙槽骨吸收、牙周袋形成，甚至導(dǎo)致牙齒松動(dòng)或拔除。菌斑微生物是牙周炎的始發(fā)因素。致病菌斑微生物通過(guò)與宿主發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，破壞牙周支持組織。除了菌斑微生物及其代謝產(chǎn)物造成的破壞外，宿主對(duì)過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生的抗炎因子也會(huì)對(duì)組織造成破壞，尤其對(duì)骨組織造成破壞。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可直接作用于成骨細(xì)胞。LPS對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著LPS濃度的升高，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的抑制作用越明顯[1]。LPS能夠明顯抑制MC3T3-E1骨結(jié)節(jié)的形成以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性[2]。柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物。研究表明，柚皮苷不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化[3]，還可以抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨的吸收[4]。但是目前關(guān)于柚皮苷抑制骨吸收的作用機(jī)制的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞形成牙周炎的體外成骨細(xì)胞骨吸收模型，以不同濃度的柚皮苷為研究對(duì)象，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)成骨細(xì)胞骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)mRNA和核因子κB受體活化因子配體(nuclear factor κB receptor activator ligand，RANKL)mRNA表達(dá)水平，旨在為臨床醫(yī)生使用柚皮苷治療牙周炎和根尖周炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器柚皮苷(四川曼斯特生物科技有限公司)；LPS、CCK-8試劑盒(中國(guó)索萊寶)；MC3T3-E1細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(北京全式金生物)；ALP活性檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天)；RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Perking Eilmer公司)；PCR儀(Eppendorf mastercycler，德國(guó))。

1.2 成骨細(xì)胞培養(yǎng)將原代MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇，檢測(cè)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞離心后，將細(xì)胞懸液按1∶2進(jìn)行傳代，每隔2 d換液1次，取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。標(biāo)記部分細(xì)胞后放入液氮罐儲(chǔ)存。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組取傳代后的MC3T3-E1細(xì)胞，以每孔1×104的密度接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組?？瞻讓?duì)照組：加入等量的二甲基亞砜，未做其他處理。LPS組：加入終濃度為1 mg·L-1的LPS。低濃度組：加入終濃度為2 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。中濃度組：加入終濃度為10 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。高濃度組：加入終濃度為20 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。對(duì)低濃度組、中濃度組、高濃度組預(yù)先用1 mg·L-1的LPS處理2 h后，再各自加入相應(yīng)濃度的柚皮苷溶液。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況 將每組細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h后再按一定比例加入(每孔20 μL)CCK-8試劑，孵育2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。操作3次取平均值。

1.4.2ALP 將細(xì)胞接種至6孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%時(shí)開(kāi)始加藥，分組情況同1.3項(xiàng)。培養(yǎng)3 d后收取細(xì)胞，胰酶消化完將細(xì)胞分成3管。一管加入RIPA裂解液提取蛋白，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值求算蛋白濃度。一管加入Trizol裂解液用來(lái)提取RNA。剩余一管用南京建成生物工程研究所的微量酶標(biāo)法來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的ALP。胰酶消化細(xì)胞前先收集細(xì)胞培養(yǎng)液用來(lái)測(cè)定培養(yǎng)液的ALP，使用酶標(biāo)儀在520 nm處測(cè)定各孔的吸光度。ALP活性=(待測(cè)樣品吸光度值-空白樣品吸光度值)/(標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值-空白樣品吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/待測(cè)樣品的總蛋白濃度。操作3次取平均值。

1.4.3RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞OPG mRNA、RANKL mRNA的水平 取1.4.2項(xiàng)中加入Trizol裂解液的成骨細(xì)胞，提取成骨細(xì)胞總RNA。采用日本Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用熒光定量PCR儀測(cè)定，設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，隨后95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。操作3次取平均值。PCR引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成，見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性的影響與空白對(duì)照組比較，LPS組成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性均較低(P<0.05)。低濃度組、中濃度組、高濃度組的成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性均高于LPS組(P<0.05)。低濃度組成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性均高于中濃度組和高濃度組，中濃度組成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性均高于高濃度組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性的影響

2.2 柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞OPG mRNA和RANKL mRNA的影響(1)LPS組OPG mRNA表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)。低濃度組、中濃度組、高濃度組OPG mRNA表達(dá)水平均高于LPS組(P<0.05)。低濃度組成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)水平高于中濃度組和高濃度組，中濃度組成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)水平高于高濃度組(P<0.05)。(2)LPS組RANKL mRNA表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)。低濃度組、中濃度組、高濃度組RNAKL mRNA表達(dá)水平均低于LPS組(P<0.05)。低濃度組成骨細(xì)胞RNAKL mRNA表達(dá)水平低于中濃度組和高濃度組，中濃度組RNAKL mRNA表達(dá)水平低于高濃度組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞OPG mRNA和RANKL mRNA的影響

3 討論

牙周炎是常見(jiàn)的口腔感染性疾病。在全國(guó)第四次口腔健康檢查中，中國(guó)有80%～96%的成年人存在不同程度的牙周問(wèn)題。牙周炎是引起成年人牙齒喪失的主要原因。牙周炎不僅影響著人類的口腔健康，還與全身多種疾病的發(fā)生息息相關(guān)，如糖尿病、心血管疾病以及癌癥等。

LPS是破壞骨組織及誘發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，不僅會(huì)刺激炎癥因子的釋放，還能抑制牙周膜干細(xì)胞分化，導(dǎo)致牙槽骨吸收甚至增加牙周炎的發(fā)病率。LPS會(huì)激活成骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路。據(jù)報(bào)道，向骨折小鼠腹腔注射LPS可以使骨折延期愈合[5]。這表明LPS可以直接抑制成骨細(xì)胞的分化。在本實(shí)驗(yàn)中，在1 mg·L-1的LPS刺激下，成骨細(xì)胞增殖能力下降，ALP活性降低，OPG mRNA水平下調(diào)，RANKL mRNA水平上調(diào)。這表明1 mg·L-1的LPS可直接抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。

柚皮苷是從天然藥物和水果中分離提純出來(lái)的一種RANKL抑制劑。近些年關(guān)于柚皮苷對(duì)骨代謝和骨形成的影響已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注。人羊水源性干細(xì)胞是一種新型的治療骨疾病的成骨細(xì)胞。Liu等[6]用柚皮苷刺激人羊水源性干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柚皮苷不僅可以促進(jìn)人羊水源性干細(xì)胞增殖分化，增加ALP活性，還可以通過(guò)BMP和Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)增加OPG表達(dá)、抑制RANKL表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)人羊水源性干細(xì)胞成骨分化，抑制其向破骨細(xì)胞分化。在本實(shí)驗(yàn)中，加入柚皮苷后可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提高ALP活性，提升OPG mRNA水平，降低RANKL mRNA水平。RANKL是TNF配體家族成員，當(dāng)RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合時(shí)，破骨細(xì)胞的分化和功能增強(qiáng)，從而發(fā)生骨吸收[7]。OPG被稱為破骨細(xì)胞抑制劑，可由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，RANKL和OPG的相對(duì)比值被認(rèn)為是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生物學(xué)和骨吸收的決定性因素和最終步驟，而且這一比值受到各種成骨激素、細(xì)胞因子和藥物的調(diào)節(jié)[8]。這表明柚皮苷溶液通過(guò)刺激成骨細(xì)胞OPG mRNA的表達(dá)，抑制RANKL mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致OPG/RANKL比值升高，進(jìn)而體現(xiàn)了柚皮苷對(duì)骨吸收的抑制作用，這與現(xiàn)有的研究結(jié)果[9]一致。Li等[10]用2、4、8、10、20 mg·L-1柚皮苷處理MC3T3-E1細(xì)胞，結(jié)果顯示不同濃度的柚皮苷均可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提高ALP活性，2 mg·L-1柚皮苷的成骨作用最顯著，隨著柚皮苷濃度的升高，成骨促進(jìn)作用變小。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即當(dāng)柚皮苷濃度為2 mg·L-1時(shí)，抑制骨吸收的作用最明顯。

綜上所述，柚皮苷可降低LPS刺激下成骨細(xì)胞RANKL mRNA水平，上調(diào)OPG mRNA水平，進(jìn)而抑制骨吸收，并且當(dāng)柚皮苷的濃度為2 mg·L-1時(shí)的效果最顯著。這對(duì)臨床醫(yī)生使用柚皮苷治療根尖周炎和牙周炎提供了理論依據(jù)。