張棋麟 ，江宇航，董志祥，羅智文，林連兵 ?

1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650500

汞被聯(lián)合國(guó)列為威脅人類(lèi)健康和環(huán)境的十大污染物之一，并受到了廣泛的關(guān)注（Morelet al.，1998；Liet al.，2009a）。汞對(duì)水體污染十分嚴(yán)重，水環(huán)境中汞主要以3種形態(tài)存在：?jiǎn)钨|(zhì)態(tài)、無(wú)機(jī)態(tài)（如氯化汞 (HgCl2，HGC) 等）和有機(jī)態(tài)（如甲基汞等）（Monteiro et al.，2010；Marceloet al.，2013）。汞是一種難降解、易遷移、高濃度、劇毒的全球重金屬污染物。因此，世界上許多水體都存在因汞含量過(guò)高而造成的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。例如，在美國(guó)卡森河流域，廢棄金礦附近的水體中總汞濃度已經(jīng)達(dá)到了2 474 ng·L-1（Morway et al.，2017）；印度西亞印第安納州，某些黃金礦區(qū)附近的河流水體中總汞含量最高可達(dá)37 300 ng·L-1（Inoue et al.，2016）；此外，中國(guó)貴州省銅仁汞礦區(qū)的地表水總汞含量也高達(dá)到81.6—4 250 ng·L-1（夏吉成等，2016）。水體汞污染作為一種典型的有害物質(zhì)，在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究和調(diào)查。然而，目前較少有研究探討水體中汞對(duì)魚(yú)類(lèi)的影響。

腸道菌群在宿主的健康與疾病中扮演了重要的角色，被稱(chēng)為宿主的第二基因組（Backhedet al.，2007）。腸道菌群功能的發(fā)揮依賴(lài)于腸道菌群的組成與結(jié)構(gòu)，當(dāng)受到外源物刺激時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂，使宿主發(fā)生炎癥甚至死亡。例如，當(dāng)成年鯉（Cyprinus carpio）暴露于含有重金屬鎘的水溶液后，會(huì)導(dǎo)致鯉腸道菌群的多樣性降低，且腸道內(nèi)益生菌Akkermansia muciniphila的相對(duì)豐度顯著下降（Changet al.，2019）；通過(guò)對(duì)暴露于重金屬鉛的成年斑馬魚(yú)進(jìn)行研究，研究者發(fā)現(xiàn)其腸道菌群的多樣性與對(duì)照組相比發(fā)生了顯著改變，并導(dǎo)致其腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生功能紊亂（Xiaet al.，2018）；鯽（Carassius auratus）腸道菌群也會(huì)隨著氨溶液暴露濃度的變化而改變（Qiet al.，2017）。此外，魚(yú)體內(nèi)的抗氧化酶防御體系對(duì)環(huán)境污染物敏感，因此魚(yú)類(lèi)組織中的抗氧化酶能作為環(huán)境污染物的生物標(biāo)記物（Ahmad et al.，2006；Oliveira et al.，2008）。有研究報(bào)道了重金屬類(lèi)污染物能在魚(yú)類(lèi)的不同組織中積累，影響體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的變化，尤其是肝組織對(duì)水體污染物的毒害反應(yīng)最為敏感，可直接影響組織中的抗氧化酶系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和造成機(jī)體損傷等（劉林等，2015a）。以上研究表明，水體污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝組織影響巨大，對(duì)魚(yú)類(lèi)的健康造成了威脅。然而，迄今為止，人們對(duì)汞如何影響?hù)~(yú)類(lèi)腸道菌群及肝組織抗氧化性能的認(rèn)識(shí)仍較為有限。

斑馬魚(yú)（Danio rerio）是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）推薦使用的魚(yú)類(lèi)毒性試驗(yàn)動(dòng)物，因此被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、環(huán)境保護(hù)、發(fā)育生物學(xué)等研究，已成為一種重要的生物模型（宋志慧等，2012；Maet al.，2013）。當(dāng)斑馬魚(yú)暴露于水體污染物時(shí)，其能在不同層面上（如行為、生理、表型、基因表達(dá)等）對(duì)環(huán)境非生物壓力做出不同程度的響應(yīng)，因此被稱(chēng)為水環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的“活監(jiān)測(cè)儀”（Huet al.，2016）。然而，斑馬魚(yú)腸道菌群和肝臟抗氧化酶活性對(duì)重金屬污染物的響應(yīng)研究并不多見(jiàn)，尤其針對(duì)汞的相關(guān)報(bào)道還未發(fā)現(xiàn)。本研究以模式生物斑馬魚(yú)為對(duì)象，通過(guò)汞暴露誘發(fā)斑馬魚(yú)成魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟中抗氧化酶活性的變化，旨在探討水體中汞對(duì)斑馬魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 斑馬魚(yú)樣品及試驗(yàn)方法

研究使用成年斑馬魚(yú)，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)斑馬魚(yú)資源中心（CZRC，http://en.zfish.cn/）。所有斑馬魚(yú)都飼養(yǎng)于連續(xù)曝氣的300 L水族箱中，并配備溫度、光照和供氧控制裝置，光周期白天和黑夜比為14 h?10 h，水溫 (25±1) ℃，酸堿度為 (7.0±5)，導(dǎo)電性為850—900 μs·cm-1。斑馬魚(yú)氯化汞暴露實(shí)驗(yàn)根據(jù)我們以前的方法進(jìn)行（Zhanget al.，2020）。首先，在無(wú)菌容器中配置0.1%（1 g·L-1）的氯化汞（HgCl2，HGC，Sigma-Aldrich，美國(guó)）母液。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全按照昆明理工大學(xué)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理道德和福利的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（KMUSTA-2019723-01）。將40尾大小相似 (3.8±0.3) cm的成年斑馬魚(yú)平均分為2個(gè)組（每組20條），分別飼養(yǎng)于兩個(gè)獨(dú)立水族箱內(nèi)（1.5 L）。HGC暴露實(shí)驗(yàn)組（DRM）的斑馬魚(yú)暴露在濃度為30 μg·L-1（采用冷原子熒光法測(cè)定水中Hg2+濃度（Wang et al.，2015），Hg2+濃度約為21.3 μg·L-1（Zhanget al.，2020）的HGC。在斑馬魚(yú)基因表達(dá)、氧化壓力、荷爾蒙和生殖系統(tǒng)等對(duì)汞暴露響應(yīng)的條件下，此濃度的氯化汞顯然能對(duì)成年斑馬魚(yú)腸道及肝組織功能造成影響（Zhanget al.，2016；Zhanget al.，2020）。以往的研究表明：30 μg·L-1氯化汞對(duì)成年斑馬魚(yú)生殖毒理學(xué)相關(guān)指標(biāo)和腸道基因表達(dá)等產(chǎn)生影響，故本研究選取30 μg·L-1的氯化汞作為成年斑馬魚(yú)汞暴露濃度（Zhanget al.，2016；Zhanget al.，2020）。此外，不含氯化汞水族箱中的斑馬魚(yú)個(gè)體作為對(duì)照組（DRC）。在飼養(yǎng)24 h后，分別隨機(jī)收集處理和對(duì)照組中的斑馬魚(yú)樣品各15尾。該實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)（處理組：DRM-1、2、3；對(duì)照組：DRC-1、2、3）避免單次取樣和斑馬魚(yú)個(gè)體間引起的隨機(jī)及偶然誤差。因本研究?jī)H關(guān)注氯化汞暴露及未暴露組間斑馬魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟抗氧化酶活間的差異，以期探討汞暴露對(duì)斑馬魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響，故本研究?jī)H設(shè)置了一個(gè)斑馬魚(yú)汞暴露組。收集后斑馬魚(yú)成體置于-80 ℃的超低溫冰箱（Sanyo，日本）。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

將樣品置于超凈工作臺(tái)（蘇坤，中國(guó)）進(jìn)行解剖。分別將每個(gè)個(gè)體腸道取出，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，用無(wú)菌水沖洗3次以去除腸道表面微生物和其中雜質(zhì)。采用TIANamp Stool DNA Kit（天根生物技術(shù)公司，中國(guó)）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物（V1—V9，正向引物：AGRGTTTGATYMTGGCTCAG；反向引物：GGYTACCTTGTTACGACTT、Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs，英國(guó)）和高保真酶混合體系進(jìn)行16S全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒（Qiagen，德國(guó)）試劑盒進(jìn)行膠回收。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

純化后的16S基因全長(zhǎng)采用SMRT Bell Template Prep Kit（Pacific Biosciences，美國(guó)）試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建：使用DNA黏合酶將測(cè)序接頭連接在擴(kuò)增好的DNA片段兩端，用AMpure PB磁珠對(duì)DNA片段進(jìn)行純化選擇，構(gòu)建SMRT Bell文庫(kù)。純化后的片段經(jīng)buffer回溶后，使用BluePipin片段篩選特定大小的片段，并AMpure PB磁珠對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)Qubit 3.0熒光計(jì)（英濰捷基，美國(guó)）進(jìn)行濃度定量，并利用Agilent 2100（安捷倫，美國(guó)）確認(rèn)插入片段長(zhǎng)度，隨后用PacBio Sequel（Pacific Biosciences，美國(guó)）平臺(tái)對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

將PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出bam格式文件。使用Lima軟件根據(jù)barcode序列區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù)，所有樣本的序列以bam格式保存。然后使用CCS（SMRT Link v5.0）對(duì)序列進(jìn)行校正，矯正參數(shù)為：CCS=3，最小準(zhǔn)確率為0.9，并去除長(zhǎng)度小于1 340 bp、最長(zhǎng)序列長(zhǎng)度大于1 640 bp的序列，以fastq和fasta保存；隨后進(jìn)行SSR過(guò)濾并使用cutadapt去除掉引物，將含有連續(xù)相同堿基數(shù)＞8的序列過(guò)濾掉。經(jīng)過(guò)以上處理后得到的reads需要進(jìn)行去除嵌合體序列（http://www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html）的處理，reads序列通過(guò)（UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html）與全長(zhǎng)注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads）。

利 用Uparse軟 件（Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）對(duì)所有樣品的全部clean reads進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs（operational taxonomic units），同時(shí)會(huì)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)肕othur方 法 與SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8—1.0），獲得分類(lèi)學(xué)信息并分別在各個(gè)分類(lèi)水平：kingdom（界）、phylum（門(mén)）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/）軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。最后，對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）（Caporasoet al.，2010）計(jì)算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE，Goods-coverage指數(shù)。Alpha和Beta多樣性指數(shù)組間差異分析均進(jìn)行有參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)，當(dāng)滿(mǎn)足參數(shù)假設(shè)條件，則組間兩兩比較選用T-test檢驗(yàn)；反之，則使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)測(cè)試組間差異的顯著水平，統(tǒng)計(jì)分析采用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行。采用Qiime軟件計(jì)算Unifrac距離。使用R語(yǔ)言（Version 2.15.3）vegan軟件包繪制NMDS圖。

1.5 肝臟抗氧化酶活性檢測(cè)

解剖收集成年斑馬魚(yú)肝臟，后在預(yù)冷勻漿培養(yǎng)基（0.01 M Tris-HCl、0.001 M EDTANa2、0.01 M蔗糖、pH7.4）中研磨，以3 000 r·min-1離心，收集上清液以測(cè)定酶活性（劉林等，2015a）。然后將上清液與酶底物孵育，使用UV-8000ST分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）以指定波長(zhǎng)讀取。酶活性檢測(cè)一式三份。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px，E.C.1.11.1.9）、過(guò)氧化氫酶（CAT，E.C.1.11.1.6）、超氧化物歧化酶（SOD，E.C.1.15.1.1）、過(guò)氧化物酶（POD，E.C.1.11.1.7）活性和丙二醛（MDA）水平，并用作生化指標(biāo)。商業(yè)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建城生物工程研究所（南京，中國(guó)，http://elder.njcbio.com/index_en.php），所有酶活性檢測(cè)均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)量。采用GSH-Px活性測(cè)定試劑盒（目錄號(hào)：A005-1-2）測(cè)量GSH-Px活性。GSH-Px催化還原型谷胱甘肽還原過(guò)氧化氫，在420 nm處檢測(cè)其吸光度。使用CAT活性測(cè)定試劑盒（目錄號(hào)：A007-1-1）測(cè)量CAT活性。CAT能催化過(guò)氧化氫的分解，鉬酸銨能迅速阻止過(guò)氧化氫的分解。剩下的過(guò)氧化氫可以很快與鉬酸銨結(jié)合，生成一種淡黃色的絡(luò)合物，可以在405 nm處測(cè)量。采用總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測(cè)試劑盒（羥胺法）（目錄號(hào)：A001-1-2）在550 nm處測(cè)定SOD活性。POD活性用過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒（目錄號(hào)A084-1-1）測(cè)定，POD能催化過(guò)氧化氫反應(yīng)；酶活性用420 nm吸光度變化測(cè)定。使用丙二醛測(cè)定試劑盒（TBA法）（目錄號(hào)：A003-1-1）在532 nm的吸收波長(zhǎng)下測(cè)量丙二醛水平。用總蛋白測(cè)定試劑盒（雙辛酸法）（目錄號(hào)：A045-4-1）在562 nm處測(cè)定粗酶提取物中的可溶性蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)

對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)的6個(gè)斑馬魚(yú)腸道菌群測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，一共得到71 472條原始序列，質(zhì)量控制后，得到69 344高質(zhì)量序列；一共獲得堿基100 717 757 bp，平均長(zhǎng)度為1 450 bp。單獨(dú)樣品的測(cè)序結(jié)果如表1所示。有效序列和原始序列的比值為96.72%。每個(gè)樣品詳細(xì)數(shù)據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)和過(guò)濾后數(shù)據(jù)信息見(jiàn)表1。

表1 不同斑馬魚(yú)腸道菌群樣品16S rDNA測(cè)序基本信息Table 1 Information of 16S rDNA sequencing of different gut flora samples in zebrafish

2.2 斑馬魚(yú)腸道菌群Alpha和Beta多樣性分析

NMDS（Stress＜0.001）結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組顯著分開(kāi)，且各自生物學(xué)重復(fù)間具有更近的距離（圖1）。本研究通過(guò)Alpha多樣性指數(shù)反映微生物群落的豐富度和多樣性。使用Chao 1、ACE指數(shù)反映群落豐富度，使用Shannon、Simpson指數(shù)反映群落多樣性。使用Coverage指數(shù)反應(yīng)群落覆蓋度（表2）。通過(guò)對(duì)是否暴露于重金屬汞的斑馬魚(yú)腸道菌群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，HGC暴露顯著影響斑馬魚(yú)腸道菌群的多樣性（ACE，P=0.004 6；Chao 1，P=0.008 7；Shannon，P=0.017 0；Simpson，P=0.059 0）。這些結(jié)果表明，HGC暴露顯著降低了斑馬魚(yú)腸道菌群的多樣性。Coverage指數(shù)均大于0.983，表明測(cè)序飽和，所測(cè)數(shù)據(jù)充分。

圖1 不同處理樣品NMDS圖Fig.1 NMDS plots for different samples

2.3 腸道菌群組成及優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度分析

對(duì)斑馬魚(yú)腸道菌群測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋后，得到門(mén)、屬等分類(lèi)單元信息。其中，在門(mén)分類(lèi)單元中，相對(duì)豐度最高的為梭桿菌門(mén)（Fusobacteria），其次為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、Melainabacteria和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria） （圖2A）。在屬分類(lèi)單元中，相對(duì)豐度最高的為鯨桿菌屬（Cetobacterium），鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas），芽孢桿菌屬（Bacillus），鏈球菌屬（Streptococcus），鄰單胞菌屬（Plesiomonas），氣單胞菌屬（Aeromonas），Burkholderiaceae，尿素芽胞桿菌屬（Ureibacillus），醋桿菌屬（Acetobacter），腸球菌屬（Enterococcus）（圖2B）。

表2 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics for diversity indices

為探索HGC暴露對(duì)斑馬魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，本研究定義相對(duì)豐度前十的菌群為優(yōu)勢(shì)菌群，并進(jìn)一步對(duì)其在對(duì)照組和HGC處理組間的相對(duì)豐度差異進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：相比于對(duì)照組，HGC暴露后，梭桿菌門(mén)（P=0.000 0）、變形菌門(mén)（P=0.000 2）、厚壁菌門(mén)（P=0.015 3）、擬桿菌門(mén)（P=0.030 4）、放線(xiàn)菌門(mén)（P=0.005 5）、藍(lán)藻菌門(mén)（P=0.001 9）、浮霉菌門(mén)（P=0.000 2）等7個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度發(fā)生了顯著變化（表3）。其中，梭桿菌門(mén)的相對(duì)豐度上升幅度最大，與對(duì)照組中未明顯檢測(cè)相比其相對(duì)豐度上升至處理組中的75%以上；相反，變形菌門(mén)的相對(duì)豐度下降幅度最大，其在對(duì)照組樣品中相對(duì)豐度約占75%，而在處理組樣品中卻僅占約20%，約降低了近4倍；同時(shí)，厚壁菌門(mén)也顯示了顯著的下降幅度，處理組中厚壁菌門(mén)細(xì)菌僅為對(duì)照組中約不足30%。此外，在屬水平，鯨桿菌屬（P=0.000 0）、鞘脂單胞菌屬（P=0.000 2）、芽孢桿菌屬（P=0.006 8）、鏈球菌屬（P=0.011 2）、氣單胞菌屬（P=0.019 6）、尿素芽胞桿菌屬（P=0.016 1）、腸球菌屬（P=0.007 6）等7個(gè)屬細(xì)菌的相對(duì)豐度在斑馬魚(yú)HGC暴露下也發(fā)生了顯著改變。其中，鯨桿菌屬、鏈球菌屬和氣單胞菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度上呈現(xiàn)出顯著的上升幅度，尤其是鯨桿菌屬的細(xì)菌上升幅度最大，從對(duì)照組中未明顯檢測(cè)到上升至處理組中的75%以上；相反，鞘脂單胞菌屬、芽孢桿菌、解脲芽孢桿菌屬和腸球菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度上呈現(xiàn)出顯著的下降幅度，尤其是鞘脂單胞菌屬的細(xì)菌，從對(duì)照組樣品中的約70%相對(duì)豐度下降至處理組樣品中的低于5%（表4）。

圖2 門(mén)（A）、屬（B）水平腸道菌群組成Fig.2 Composition of gut flora at Phyla (A) and Genera (B) level in treatment and control groups

表3 門(mén)分類(lèi)單元下相對(duì)豐度前10細(xì)菌的變化Table 3 Changes in relative abundance of top10 bacteria phylum taxa

2.4 肝臟抗氧化酶活性

成年斑馬魚(yú)HGC暴露后，肝臟抗氧化酶GSH-Px、CAT和SOD活性發(fā)生顯著上升或下降（P＜0.05），而POD活性略有上升，但差異不顯著（P＞0.05）（表5）。另外，相比對(duì)照組，HGC暴露組肝臟MDA水平發(fā)生顯著上升（P＜0.05）。具體來(lái)看，HGC暴露后，斑馬魚(yú)肝組織的GSH-Px活性(41.79±7.11) U·mg-1與對(duì)照組的GSH-Px活性(23.61±4.98) U·mg-1相比顯著增高1.77倍；HGC暴露后，斑馬魚(yú)肝組織的SOD活性 (74.12±9.32)U·mg-1與對(duì)照組的SOD活性 (31.22±6.47) U·mg-1相比顯著升高到了2.37倍；與此同時(shí)，MDA水平在斑馬魚(yú)HGC暴露前后變化最為劇烈，由(4.71±0.51) nmol·mg-1升 高 到 (31.26± 5.58)nmol·mg-1，升幅高達(dá)6.64倍。但通過(guò)HGC暴露處理成年斑馬魚(yú)后，卻誘發(fā)了肝臟中CAT活性發(fā)生顯著下降由對(duì)照組（(132.63±13.87) U·mg-1下降至(53.71±8.16) U·mg-1，2.47倍）。

表4 屬分類(lèi)單元下相對(duì)豐度前10的變化Table 4 Changes in relative abundance of the top10 in genera taxa

表5 汞暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟抗氧化酶（谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶）活性和丙二醛水平的影響Table 5 Effect of mercury exposure on the activity of antioxidant enzymes (GSH-Px, CAT, SOD, POD) and MDA levels in zebrafish liver

3 討論

3.1 汞暴露對(duì)斑馬魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

本研究通過(guò)第三代測(cè)序技術(shù)對(duì)對(duì)照和HGC暴露的斑馬魚(yú)腸道菌群進(jìn)行16S rDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得了一批高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，保證了下游腸道菌群結(jié)構(gòu)分析的可靠性。NMDS分析表明實(shí)驗(yàn)處理恰當(dāng)，不同處理的生物學(xué)重復(fù)樣品各自聚在一起，且處理和對(duì)照組明顯分開(kāi)，顯示了斑馬魚(yú)腸道菌群在HGC暴露后產(chǎn)生了明顯不同的結(jié)構(gòu)特征。研究結(jié)果進(jìn)一步顯示對(duì)照組斑馬魚(yú)腸道菌群多樣性顯著高于HGC暴露組斑馬魚(yú)，可見(jiàn)腸道菌群多樣性下降也是菌群結(jié)構(gòu)變化的重要特征之一。此外，利用重金屬銅處理異育銀鯽（Carassius auratus）后，腸道微生物發(fā)生多樣性出現(xiàn)顯著下降（涂宗財(cái)?shù)龋?017），而且斑馬魚(yú)短期暴露于霜霉威鹽酸鹽時(shí)，腸道菌群的多樣性也會(huì)發(fā)生顯著下降（Zhanget al.，2018）。這些證據(jù)進(jìn)一步支持了HGC暴露可以降低斑馬魚(yú)腸道菌群的多樣性，腸道菌群多樣性的下降可能是外源環(huán)境的強(qiáng)烈刺激對(duì)機(jī)體正常生命活動(dòng)造成的一種損傷機(jī)制。當(dāng)然，這還需要通過(guò)降低或提高斑馬魚(yú)腸道菌群多樣性后，比較不同腸道菌群多樣性斑馬魚(yú)間的行為、生理和生化等指標(biāo)來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)。另外，斑馬魚(yú)腸道菌群多樣性的降低或可作為一個(gè)對(duì)水環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的潛在指標(biāo)。

在門(mén)分類(lèi)水平，梭桿菌門(mén)，變形菌門(mén)，厚壁菌門(mén)為的斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌相對(duì)豐度占據(jù)前三，尤其梭桿菌和變形菌占絕大多數(shù)，該研究結(jié)果與以往大部分針對(duì)成年斑馬魚(yú)腸道菌群的研究結(jié)果相似（Bates et al.，2006；Wonget al.，2015；Zhanget al.，2019），顯示了本研究測(cè)序及分析結(jié)果的可靠。同時(shí)，斑馬魚(yú)暴露于HGC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其腸道優(yōu)勢(shì)菌群中的梭桿菌門(mén)相對(duì)豐度發(fā)生了顯著上升，而變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度發(fā)生了顯著下降，這也進(jìn)一步表明斑馬魚(yú)暴露于HGC后，其腸道菌群在門(mén)水平的相對(duì)豐度會(huì)受到顯著影響。以往研究表明，暴露于高濃度的殺菌劑抑霉唑21 d后，斑馬魚(yú)腸道內(nèi)的變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著下降，而厚壁菌門(mén)的豐度顯著上升（Jinet al.，2017），厚壁菌門(mén)的變化趨勢(shì)同幼年斑馬魚(yú)暴露于微塑料7 d后的一致（Wanet al.，2019）。然而，作為常見(jiàn)的重金屬污染物，砷會(huì)改變小鼠腸道微生物的組成，造成厚壁菌門(mén)的豐度顯著降低（Luet al.，2014）。可見(jiàn)，不同水體污染物造成的腸道細(xì)菌在門(mén)水平類(lèi)型和變化趨勢(shì)上存在較大差異。

在屬分類(lèi)水平，7個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度對(duì)斑馬魚(yú)HGC暴露發(fā)生了顯著的響應(yīng)，其中鯨桿菌屬、鏈球菌屬和氣單胞菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度上發(fā)生了顯著上升，鞘脂單胞菌屬、芽孢桿菌、解脲芽孢桿菌屬和腸球菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度發(fā)生顯著下降，這與涂宗財(cái)?shù)龋?017）利用重金屬銅對(duì)異育銀鯽腸道處理后鯨桿菌屬和氣單胞菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度發(fā)生顯著上升，芽孢桿菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度發(fā)生顯著下降，具有一定相似性。盡管一些相對(duì)豐度顯著改變的細(xì)菌的生物學(xué)功能尚不清楚，但其中部分細(xì)菌類(lèi)群與代謝、疾病和炎癥密切相關(guān)。例如，鯨桿菌屬是魚(yú)類(lèi)腸道和糞便中的優(yōu)勢(shì)菌群（Sylvain et al.，2017），是魚(yú)類(lèi)微生物屏障功能的重要組成部分。當(dāng)前環(huán)境污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道鯨桿菌屬類(lèi)群影響的研究還極為鮮見(jiàn)，本研究首次報(bào)道了重要水體重金屬污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道鯨桿菌屬細(xì)菌的影響。不過(guò)，在魚(yú)類(lèi)病原菌對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道菌群影響的研究中已發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilis）感染顯著提高了成年草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）腸道內(nèi)鯨桿菌屬菌群的相對(duì)豐度（李東亮，2016）。本研究結(jié)果顯示：當(dāng)斑馬魚(yú)暴露于HGC時(shí)，腸道內(nèi)鯨桿菌的相對(duì)豐度會(huì)顯著增加。這些證據(jù)暗示了鯨桿菌屬相對(duì)豐度的增加可能是魚(yú)類(lèi)遭受外源物刺激誘發(fā)的一個(gè)腸道細(xì)菌標(biāo)志。此外，鞘脂單胞菌屬是魚(yú)類(lèi)重要的益生菌（余桂娟等，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)鞘脂單胞菌相對(duì)豐度在斑馬魚(yú)HGC暴露下，豐度顯著降低。芽孢桿菌能對(duì)斑馬魚(yú)腸道有較好的黏附，具有免疫調(diào)節(jié)和免疫保護(hù)作用，能有效刺激斑馬魚(yú)腸道黏膜的抗炎反應(yīng)和屏障再生，提高斑馬魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌感染的免疫抵抗能力（Wanget al.，2015）。尿素芽胞桿菌和腸球菌在斑馬魚(yú)腸道中的角色還鮮有報(bào)道，但這兩類(lèi)細(xì)菌已廣泛作為動(dòng)物腸道益生菌。鏈球菌和氣單胞菌是自然界重要的魚(yú)類(lèi)病原菌，其病害是水產(chǎn)業(yè)的主要威脅之一，斑馬魚(yú)已被用于作為鏈球菌和氣單胞菌疾病研究的模型（Neelyet al.，2002；Ayaz Ahmedet al.，2018）。這些證據(jù)表明，水體HGC暴露誘導(dǎo)成年斑馬魚(yú)腸道菌群失調(diào)，主要益生菌和病原菌的相對(duì)豐度都產(chǎn)生了顯著改變。

3.2 汞暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟抗氧化酶的影響

活性氧種類(lèi)（reactive oxygen species，ROS）和過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）水平由抗氧化防御機(jī)制的協(xié)同作用控制，抗氧化酶的活性是氧化應(yīng)激、細(xì)胞膜和DNA損傷程度以及過(guò)量ROS和H2O2消除的潛在指標(biāo)（劉林等，2015b；Zhenget al.，2019）。大量的研究顯示水體污染物能引誘機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的ROS和H2O2，從而損傷器官和組織（Livingstone，2003；Valavanidiset al.，2006）。GSH-PX在CAT含量較低的組織中具有與CAT相似的作用，可以去除H2O2，防止H2O2對(duì)組織的氧化損傷（Eliaet al.，2006）。已有大量研究報(bào)道了GSH-PX在魚(yú)類(lèi)遭受水體污染物脅迫中的抗氧化防御作用。例如，研究發(fā)現(xiàn)水體中Cu2+暴露能顯著提高銀鯧（Pampus gentareus）幼魚(yú)組織中的GSH-PX活性，造成抗氧化防御系統(tǒng)的破壞（周健愷等，2014）。本研究中，斑馬魚(yú)HGC暴露前，肝臟中GSH-Px水平較低時(shí)具有良好的抗氧化防御作用，然而，HGC暴露后，GSH-PX活性急劇上升，表明汞暴露可促進(jìn)斑馬魚(yú)肝臟中抗氧化酶系統(tǒng)的損傷。

CAT作為清除ROS的第一道防線(xiàn)（Udayangani et al.，2017），且CAT是過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶，能催化H2O2的分解，從而使細(xì)胞免于遭受ROS和H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一（劉林等，2015a）。以前的研究發(fā)現(xiàn)，鉛對(duì)鯽魚(yú)組織中的CAT活性有一定的抑制作用（成嘉等，2006）；也有研究報(bào)道了一種印度的淡水魚(yú)Wallago attu在污染水體中，魚(yú)體內(nèi)的CAT活性較清潔水體中的低（Pandeyet al.，2003）。CAT活性下降可能是重金屬通過(guò)置換出金屬酶活性中的必要金屬或結(jié)合到酶蛋白分子中的巰基、羧基等功能基團(tuán)而導(dǎo)致的，當(dāng)機(jī)體中抗氧化酶活性受到抑制后，清除自由基能力下降（劉林等，2015a）。在本研究中，與對(duì)照組相比，斑馬魚(yú)HGC暴露顯著降低了肝組織CAT活性，表明水體汞對(duì)斑馬魚(yú)肝組織可能造成了氧化損傷。另外，CAT也可能是一種潛在的水環(huán)境汞污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估酶學(xué)標(biāo)志物，顯示了其用于評(píng)估汞暴露對(duì)魚(yú)類(lèi)肝組織損傷程度的潛力。

SOD在魚(yú)類(lèi)抗氧化酶系統(tǒng)中起重要作用，是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵指示物，早已作為一種酶學(xué)標(biāo)志物用于水環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（Carla et al.，2002）。SOD維持著機(jī)體的氧化（自由基產(chǎn)生）與抗氧化（自由基清除）平衡，它能通過(guò)清除超氧陰離子保護(hù)機(jī)體免受損傷（劉林等，2015a）。在哺乳動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到氧化壓力，生物體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)比正常情況下多數(shù)倍的SOD來(lái)清除過(guò)量的氧自由基，避免機(jī)體受到氧化損傷（Kellyet al.，1998）。以往研究也報(bào)道了納米氧化鋅暴露不同的時(shí)間，斑馬魚(yú)肝組織中的SOD活性上升3—5倍不等，表明了納米氧化鋅暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝的氧化損傷（劉林等，2015a）。本研究中，HGC暴露導(dǎo)致了斑馬魚(yú)肝組織中SOD活性升高，進(jìn)一步表明汞對(duì)斑馬魚(yú)的肝組織造成了氧化損傷，而斑馬魚(yú)肝組織通過(guò)產(chǎn)生更多的SOD阻止或減緩損傷進(jìn)程。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，是細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷的重要指標(biāo)之一，其水平可用于評(píng)估組織受損傷程度（Al-Bairutyet al.，2013；劉林等，2015a）。先前的研究表明，汞暴露濃度為15 μ·mL-1時(shí)，可導(dǎo)致斑馬魚(yú)卵巢內(nèi)的MDA水平顯著上升（Zhanget al.，2016）；劉占才等（2016）也發(fā)現(xiàn)濃度為0.5 μg·mL-1的汞暴露5 d后，草魚(yú)腎臟中的MDA水平會(huì)出現(xiàn)顯著上升；劉林等（2015a）甚至發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅在水體中濃度超過(guò)0.01 μg·mL-1時(shí)，就能誘導(dǎo)斑馬魚(yú)肝組織中的MDA水平明顯升高，并提出這種現(xiàn)象可能是組織細(xì)胞受污染物的脅迫產(chǎn)生過(guò)多的自由基，損傷細(xì)胞膜膜脂中的不飽和脂肪酸，破壞了細(xì)胞膜正常的結(jié)構(gòu)和膜內(nèi)外物質(zhì)交換，從而產(chǎn)生大量的MDA。本研究也顯示了，汞暴露斑馬魚(yú)時(shí)，其肝組織中的MDA水平上升數(shù)倍，表明汞暴露給斑馬魚(yú)肝中的抗氧化酶系統(tǒng)帶來(lái)了巨大氧化壓力，破壞了肝組織的正常功能和解毒能力。此外，本研究中，僅在24 h汞暴露后，斑馬魚(yú)肝中丙二醛水平就有較大幅度升高，說(shuō)明汞暴露可在較短時(shí)間內(nèi)造成斑馬魚(yú)的肝損傷。

4 結(jié)論

（1）本研究首次采用第三代測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析，研究了重金屬汞暴露前后魚(yú)類(lèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)，并比較了它們之間的差異。研究結(jié)果證實(shí)了汞暴露引起斑馬魚(yú)腸道菌群多樣性顯著下降，以降低斑馬魚(yú)的抗逆能力，這可能是水體污染物損傷魚(yú)類(lèi)的一種潛在機(jī)制。

（2）水體汞暴露能使斑馬魚(yú)腸道菌群中的梭桿菌門(mén)、益生菌鯨桿菌屬、魚(yú)類(lèi)病原菌氣單胞菌屬和鏈球菌屬相對(duì)豐度顯著上升；變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)、浮霉菌門(mén)等6個(gè)門(mén)，鞘脂單胞菌屬、芽孢桿菌屬、尿素芽胞桿菌屬、腸球菌屬等4個(gè)屬腸道益生菌的相對(duì)豐度顯著下降。

（3）水體汞暴露能使斑馬魚(yú)肝組織中抗氧化酶活性受到影響，引起肝組織中氧化酶及抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致肝組織受損，且這種損傷在短時(shí)間（24 h）內(nèi)即可產(chǎn)生。