彭婷婷 徐曉萍 朱曉蕾 董 耀

(江蘇省生產(chǎn)力促進(jìn)中心，江蘇 南京 210042)

己烯雌酚為人工合成的非甾體類(lèi)雌激素物質(zhì)，能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用[1-5]，主要添加在飼料中,能引起人體內(nèi)激素失調(diào)等疾病。研究發(fā)現(xiàn),其在動(dòng)物性產(chǎn)品中的殘留對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境都會(huì)造成嚴(yán)重危害[6]。

雌酚在上世紀(jì)七八十年代作為類(lèi)雌激素藥物廣泛用于口服避孕以及防止流產(chǎn)。它可以促使女性性器官及副性征正常發(fā)育，使子宮內(nèi)膜增生以及陰道上皮角化，減輕婦女更年期或婦科手術(shù)后因性腺功能不足而產(chǎn)生的內(nèi)分泌功能紊亂，增強(qiáng)子宮收縮，提高子宮對(duì)催產(chǎn)素的敏感性。己烯雌酚剛一問(wèn)世就受到廣泛歡迎。許許多多的人不用再擔(dān)心孩子的出生，以及孩子的無(wú)法出生。然而，當(dāng)時(shí)人們完全沒(méi)有認(rèn)識(shí)到它的危害性，直至大量使用己烯雌酚的女性的孩子出生之后，問(wèn)題來(lái)了，并且在孩子青春期之后更加集中表現(xiàn)出來(lái)。服用過(guò)己烯雌酚的人生下的女孩，其陰道和宮頸細(xì)胞都有不同程度的病變。研究表明，陰道透明細(xì)胞腺癌近幾年在少女和年輕婦女中的發(fā)病率有增加趨勢(shì)。據(jù)調(diào)查，這些病人在出生前就受到過(guò)己烯雌酚的影響。胎兒期接觸過(guò)己烯雌酚的婦女，24歲時(shí)患本病的累積危險(xiǎn)性是0.14%～1.4%。還有相當(dāng)多的人有子宮頸和陰道的良性組織改變，稱(chēng)為腺瘤病。通過(guò)對(duì)胎兒期接觸過(guò)己烯雌酚?jì)D女的常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)，約有1/3的人有上述異常。

在胎兒期接觸過(guò)己烯雌酚的男性中，生殖系統(tǒng)異常的發(fā)生率也很高。這些病人與相同年齡組、在胎兒期未接觸過(guò)已烯雌酚的人相比，睪丸異常的發(fā)生率有顯著增加。這些病例，我們稱(chēng)之為“DES綜合癥”。同時(shí)，懷孕期間服用己烯雌酚還可造成胎兒畸形，使女性男性化、男性女性化，甚至引起腦積水、腦脊膜膨出等。同時(shí)，對(duì)孕婦還可能造成肝臟和腎臟的損害，使哮喘的發(fā)病率明顯上升，還可能促使膽汁中的膽固醇飽和而形成結(jié)石，誘發(fā)胰腺炎和血管栓塞性疾病。這時(shí)人們才發(fā)現(xiàn)，己烯雌酚是一種環(huán)境激素，與雌激素受體結(jié)合后會(huì)干擾人的內(nèi)分泌，誘發(fā)生殖器病變與腫瘤。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品:己烯雌酚(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液:水；甲酸；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher scientific)。

1.2 主要儀器

LC-MS(CLARUS SQ 8，PekinElmer)。

1.3 樣品處理

將樣品制成均勻的顆粒，稱(chēng)取2.0 g，精確至0.1 mg，置于50 mL帶磨口塞子的試管中，加入萃取劑甲醇。放入40 ℃超聲水浴儀中超聲萃取，萃取液經(jīng)離心，過(guò)濾，定容至10 mL，過(guò)膜，作為待測(cè)樣。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：ELITE-5HT,15 cm×0.25 mm×0.10 μm；進(jìn)樣口溫度35 ℃；載氣：氮?dú)?，流量?.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；電離源：ESI；流動(dòng)相：0.1%甲酸/乙腈=40/60；己烯雌酚母離子269.2，子離子135.2和107.2，碰撞能量分別為10 V和20 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波萃取條件的優(yōu)化

本文將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)己烯雌酚作為研究對(duì)象，在超聲波萃取中，通過(guò)分析該標(biāo)準(zhǔn)樣品，對(duì)萃取時(shí)間和溶劑量進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 最佳萃取時(shí)間的選擇

為了得到樣品最佳萃取時(shí)間，選用甲醇作為萃取溶劑，溶劑量為10 mL，依次設(shè)定萃取時(shí)間7.5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min，結(jié)果見(jiàn)圖1?？芍?，樣品在萃取30 min之后，己烯雌酚的萃取率大于99%,且穩(wěn)定，因此其最佳萃取時(shí)間為30 min。

圖1 超聲波萃取時(shí)間與萃取率的關(guān)系圖Fig.1 Relationship between extraction time and sample extraction rate

2.1.2 最佳溶劑量的選擇

溶劑量也是影響超聲波萃取效果的主要因素，根據(jù)2.1.1的結(jié)果，超聲萃取時(shí)間30 min，甲醇的用量為5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。由圖可得，其最佳溶劑量為10～15 mL。

圖2 超聲波萃取溶劑量與萃取率的關(guān)系圖Fig.2 Relationship between extraction solvent content and sample extraction rate

2.2 方法的線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)

配制濃度為20,50,80，100,150,200 ng/mL的一系列己烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在前述的儀器分析條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。如圖3所示，采用液質(zhì)聯(lián)用的方法，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.999，可知標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)具有良好的線(xiàn)性。

圖3 己烯雌酚線(xiàn)性圖譜Fig.3 The linear graph of stilbestrol in LC-MS

2.3 實(shí)際樣品的檢測(cè)

2.3.1 回收率實(shí)驗(yàn)

采用上述優(yōu)化的參數(shù)條件對(duì)自備實(shí)際樣品進(jìn)行前處理，最后對(duì)所得樣品進(jìn)行LC-MS檢測(cè)，平行測(cè)定5次。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法來(lái)考察本方法的準(zhǔn)確性，如表1所示，回收率在96.0%～104.0%之間,RSD在2.10%～5.86%。

表1 樣品回收率Tab.1 sample recoveries

2.3.2 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證超聲波萃取/液相色譜質(zhì)聯(lián)用儀分析方法的可行性，同時(shí)還采用了液相色譜法對(duì)上述實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，所測(cè)得結(jié)果平均值相近，RSD在1.0%～1.7%之間。結(jié)果如圖4、圖5和表2所示。

圖4 液相色譜法己烯雌酚色譜圖Fig.4 The chromatogram of stilbestrol in HPLC

圖5 液相色譜法己烯雌酚的線(xiàn)性圖Fig.5 The linear graph of stilbestrol in HPLC

表2 參照實(shí)驗(yàn)Tab.2 controlled experiment.

3 結(jié)論

本文以超聲波萃取技術(shù)對(duì)動(dòng)物源性食品進(jìn)行樣品處理，采用液相色譜—質(zhì)譜法對(duì)己烯雌酚的含量進(jìn)行測(cè)定。該方法簡(jiǎn)便，高效，重復(fù)性好，回收率高。并和液相色譜法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)比較，證明了該方法的可行性。