王春霞 岳師師 毛炎佳 姜亞茹 劉玉春 燕莎 李永偉

卵泡的生長發(fā)育受下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的調(diào)控及其相關(guān)組織分泌激素的調(diào)節(jié)，從卵泡的生成到卵子的排出，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可導(dǎo)致排卵障礙[1]。TGF-β超家族的一個亞型TGF-β1及其受體TGF-β1R 在卵巢不同發(fā)育階段中均可表達(dá)[2]。補(bǔ)腎助孕顆粒是王春霞教授在長期臨床實(shí)踐中的經(jīng)驗(yàn)方，通過多年臨床觀察對于恢復(fù)月經(jīng)周期，促進(jìn)排卵具有良好的效果，且臨床觀察中未發(fā)現(xiàn)并發(fā)癥及副作用[3]。為了解該方對卵泡生長發(fā)育的作用，我們用大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對TGF-β1及受體濃度變化并進(jìn)行分析，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞大鼠卵巢顆粒細(xì)胞購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，產(chǎn)品編號：RATCELL-0077，規(guī)格：5×105cells/ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥與耗材補(bǔ)腎助孕顆粒（菟絲子，規(guī)格：10g/袋，批號:1905006C；當(dāng)歸，規(guī)格：10g/袋，批號:1906013C；枸杞子，規(guī)格：5g/袋,批號:1906001C；熟地，規(guī)格：10g/袋,批號:1905004W；制何首烏，規(guī)格：10g/袋,批號:1812003C；白芍，規(guī)格：10g/袋,批號:1906001W；川芎，規(guī)格：6g/袋,批號:1906003C；黃芪，規(guī)格：10g/袋,批號:1907001W；炙淫羊藿，規(guī)格：10g/袋，批號:1901002C；山藥，規(guī)格：10g/袋，批號:1904006W；牛膝，規(guī)格：5g/袋，批號:1906001C）廠家：三九制藥。注射用尿促性素針（HMG），廠家：麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，規(guī)格:75U，批號:180504。細(xì)胞培養(yǎng)基：批號:0012519，廠家:BI 生物公司。牛血清：批號：1924622，廠家：BI 生物公司。大鼠TGF-β1 試劑盒，批號：201812，上海江萊生物科技公司。大鼠TGF-β1R 試劑盒，批號：201812，上海江萊生物科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組選擇生長良好的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞為1×105cells/ml，用96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，并分為對照組（空白）、高劑量組（含生藥3.24g/ml）、中劑量組（含生藥1.62g/ml）、低劑量組（含生藥0.81g/ml）、HMG 組（陽性對照組），每組18 孔，37℃ 5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)，分別在1、6、12、24、48h 離心取培養(yǎng)物上清液，按大鼠TGF-β1 及受體試劑盒操作說明書進(jìn)行程序設(shè)定，用艾德康全自動酶聯(lián)免疫一體機(jī)進(jìn)行檢測，用試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)液繪制曲線進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同含量補(bǔ)腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞TGF-β1 表達(dá)量的影響對照組各個時間點(diǎn)TGF-β1 的濃度變化無差異（P＞0.05）；除HMG 組，其他各中藥組12h 濃度最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組用藥12h TGF-β1 的濃度高于高劑量組和低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HMG 組用藥6h TGF-β1 濃度最高，與其他時間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中劑量組用藥12h 與HMG 組用藥6h TGF-β1 濃度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 不同含量補(bǔ)腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞TGF-β1R 表達(dá)量的影響對照組各個時間點(diǎn)TGF-β1R 的濃度變化無差異（P＞0.05）；除HMG組其他各中藥組12h 濃度最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組用藥12h TGF-β1R 的濃度高于高劑量組和低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HMG 組用藥6h TGF-β1R 最高，與其他時間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中劑量組用藥12h 與HMG 組用藥6h TGF-β1R 濃度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 不同含量補(bǔ)腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞TGF-β1 表達(dá)量的影響情況（，ng/L）

表1 不同含量補(bǔ)腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞TGF-β1 表達(dá)量的影響情況（，ng/L）

表2 不同含量補(bǔ)腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞TGF-β1R 表達(dá)量的影響情況（，ng/L）

表2 不同含量補(bǔ)腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞TGF-β1R 表達(dá)量的影響情況（，ng/L）

3 討論

《內(nèi)經(jīng)》腎藏精，主生殖，是對人體的生殖功能的高度概括，腎中之精又有先天之精和后天之精，先天之精得到后天之精的濡養(yǎng)得以升華，為腎主生殖的根本[4]?！鹅`樞·經(jīng)脈篇》曰“人始生,先成精”。腎中精氣是孕育的物質(zhì)基礎(chǔ)，精氣的充盈與女性卵泡的生成、發(fā)育、成熟密切相關(guān)[5]。隨著高科技的發(fā)展，人們生活節(jié)奏的加快，女性承擔(dān)的壓力也隨之增大，直接影響到了女性生殖及內(nèi)分泌功能[6]，出現(xiàn)卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、閉經(jīng)、異常子宮出血等疾病的增多，從而影響到女性卵泡的發(fā)育、成熟及排出，造成女性不孕癥的增多[7]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎藥物具有類激素樣的作用，起到改善女性內(nèi)分泌的功能，促進(jìn)卵泡的發(fā)育與排出[8]。

補(bǔ)腎助孕顆粒是王春霞教授多年臨床觀察總結(jié)出來的對排卵障礙性不孕癥治療的有效方劑，具有補(bǔ)腎填精調(diào)經(jīng)助孕之功[9，10]。補(bǔ)腎助孕顆粒中熟地、菟絲子能夠補(bǔ)腎填精；制何首烏、枸杞子和當(dāng)歸能夠滋陰補(bǔ)血；白芍能夠養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；山藥、黃芪能夠益氣補(bǔ)血；川芎能夠行氣活血；牛膝能夠引血下行；配以炙淫羊藿起到陽中求陰功效。方中的活血化瘀藥能改善卵巢微循環(huán)，且促進(jìn)卵泡發(fā)育及排卵。方中的補(bǔ)腎藥能夠增強(qiáng)卵巢和垂體的功能，起到調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的功能。

TGF-β 是一個龐大的家族，主要以TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 為主，參與許多細(xì)胞生長過程，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活，其在胚胎發(fā)育中也起著重要作用，其中TGF-β1 的活性最強(qiáng)，功能也最多，臨床應(yīng)用最廣泛[11]。活化后TGF-β1 分子量為25Kd，含有112 個氨基酸，由2 條單鏈組成[12]，TGF-β1 常與其相應(yīng)受體結(jié)合后發(fā)揮作用，其在哺乳動物卵巢中主要表達(dá)于卵母細(xì)胞，促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育和卵子的成熟。我們通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用促性腺激素和補(bǔ)腎助孕顆粒都可引起TGF-β1 及其受體在卵泡發(fā)育的不同階段進(jìn)行表達(dá)，對照組各個時間點(diǎn)TGF-β1 及其受體的濃度變化無差異；補(bǔ)腎助孕顆粒各劑量組用藥后TGF-β1 及其受體的濃度均高于對照組，以給藥后12h 濃度最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組用藥12h TGF-β1 及其受體的濃度高于高劑量組和低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HMG 組用藥6h TGF-β1 及其受體濃度最高，與其他時間點(diǎn)相比差異顯著（P＜0.05）。中劑量組用藥12h 與HMG 組用藥6h TGF-β1 及其受體濃度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以，促性腺激素和補(bǔ)腎助孕顆粒在卵泡生長發(fā)育過程中都能起到促進(jìn)作用。本研究為補(bǔ)腎助孕顆粒在女性排卵障礙性不孕癥的治療方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。