韓春生 伍學(xué)強(qiáng)

流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)在急性白血?。╝cute leukemia，AL）和骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）診斷中的作用日益突出。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的變化，已成為AL 和MDS 診斷的基本標(biāo)志，但是哪些抗原才是診斷不同類型白血病的最佳標(biāo)志物，臨床工作者的意見尚不統(tǒng)一。AL 和MDS 的發(fā)病都是一些原本正常的細(xì)胞出現(xiàn)了分化紊亂，所以細(xì)胞表面抗原的變化有助于AL 和MDS的診斷。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)CD56 在AL 和MDS 的診斷和預(yù)后判斷方面具有重要意義。

CD56 是一種粘附分子，又被稱為神經(jīng)細(xì)胞粘附分子，屬免疫球蛋白超家族成員,主要存在于自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）中，也可表達(dá)于T細(xì)胞亞群、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞[1]；單核細(xì)胞異常表達(dá)CD56，常被認(rèn)為與MDS、骨髓增殖性腫瘤（myeloproliterative neoplasms，MPN）相關(guān)。漿細(xì)胞表達(dá)CD56有利于多發(fā)性骨髓瘤的診斷。CD56 可表達(dá)于包括AML、急性髓/NK 細(xì)胞白血病、急性淋巴性白血?。ˋLL）、淋巴瘤、骨髓瘤在內(nèi)的多種血液系統(tǒng)腫瘤。CD56 表達(dá)與B-ALL 高風(fēng)險(xiǎn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)相關(guān)；與T-ALL 低完全緩解率相關(guān)[2]。在AML 中，特別是AML-M2 中CD56+被認(rèn)為是預(yù)后較差的指標(biāo)[3]。研究提示[4～6]，CD56+血液腫瘤預(yù)后不良，臨床療效差，預(yù)后差，易復(fù)發(fā)，總體生存期較短，易發(fā)生髓外浸潤(rùn)。CD56 表達(dá)于MDS 和CMPN 的原始粒細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞和單核細(xì)胞[7]。CD56 表達(dá)往往提示MDS 為高危MDS，預(yù)后較差，易于向AL 轉(zhuǎn)化。表達(dá)CD56 的血液系統(tǒng)腫瘤常被認(rèn)為是具有高度侵襲性的惡性疾病[8]，所以有研究者建議初診時(shí)監(jiān)測(cè)CD56表達(dá)以判斷預(yù)后，并將CD56 作為監(jiān)測(cè)微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）的重要指標(biāo)[9，10]。CD56+的AML 患者預(yù)后目前仍存在爭(zhēng)議[11]。我們用含有CD56 單抗的五色流式方案研究了142 例初診的AL 和MDS 的免疫表型患者以期發(fā)現(xiàn)CD56 在這些疾病中的表達(dá)規(guī)律，為臨床診斷和判斷預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2013 年9 月～2019 年9 月收治的142 例初診AL 和MDS 患者。依據(jù)臨床表現(xiàn)、流式免疫表型、骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、骨髓活檢進(jìn)行確診。AL、MDS 均按照FAB 分型分類，MDS 根據(jù)骨髓原始細(xì)胞數(shù)量分成原始細(xì)胞增高組（RAEB-1、RAEB-2、CMML；骨髓原始細(xì)胞＞5%）和不增高組（RA、RAS；骨髓原始細(xì)胞＜5%）。其中AL 107 例，MDS 35 例；男69 例，女73 例，年齡2～82 歲。

1.2 材料應(yīng)用貝克曼流式細(xì)胞儀（庫(kù)爾特Cytomics FC 500），胞內(nèi)染色試劑和單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司，抗原包括髓系、淋巴細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系和紅細(xì)胞系的代表性抗原，具體包括CD2、cCD3、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD19、CD79a、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD45、CD56、CD61、CD64、CD71、CD117、HLA-DR、GlyA、MPO。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制備嚴(yán)格按照流式樣本操作流程制備細(xì)胞懸液以備上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 流式檢測(cè)按照貝克曼（庫(kù)爾特Cytomics FC 500）流式細(xì)胞儀的操作手冊(cè)開機(jī)，用Cell Quest 軟件獲取數(shù)據(jù)，每管檢測(cè)100 000 個(gè)細(xì)胞，用CD45/側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞。用Cell Quest 軟件分析檢測(cè)結(jié)果，以抗原表達(dá)量＞20%作為抗原表達(dá)陽(yáng)性的界限。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組之間比較采用方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD56 在AL 患者中表達(dá)情況用Cell Quest軟件分析檢測(cè)結(jié)果，在CD45/SSC 點(diǎn)圖上根據(jù)細(xì)胞CD45 和SSC 值將所研究細(xì)胞劃分為淋巴細(xì)胞群、單核細(xì)胞群、粒細(xì)胞群、CD45 弱表達(dá)群（主要為原始/幼稚細(xì)胞）、CD45 陰性表達(dá)細(xì)胞群（主要為有核細(xì)胞和細(xì)胞碎片）分別研究，進(jìn)一步了解不同細(xì)胞群抗原表達(dá)情況。107 例AL 患者中1 例M1、34例M2、12 例M3、4 例M4、27 例M5、2 例M6、17 例B-ALL、10 例T-ALL。以CD56 細(xì)胞＞20%計(jì)為陽(yáng)性，107 例AL 中有29 例（27.10%）的細(xì)胞群異常表達(dá)CD56。80 例AML 中有28 例表達(dá)CD56，陽(yáng)性率為35.00%，27 例ALL 中有1 例表達(dá)CD56，陽(yáng)性率為3.70%；CD56 在AML、ALL 中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.01，P＜0.05）。CD56 在AML 各亞型中的陽(yáng)性率依次為：M2（52.94%）、M5（37.04%），M1、M3、M4、M6 未檢出CD56 表達(dá)，見表1。AL 中CD56 在原始細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞中的檢出率依次為75.86%、48.28%、13.79%。

表1 CD56 在AL 患者中的表達(dá)情況（n）

2.2 CD56 在MDS 中的表達(dá)情況在MDS 中CD56可異常表達(dá)于原始細(xì)胞（28.57%）、粒細(xì)胞（20.00%）、單核細(xì)胞（5.71%）。CD56 在原始細(xì)胞中表達(dá)比例最高。

35 例MDS 患者中原始細(xì)胞增高組的MDS 患者CD56 陽(yáng)性率為54.55%,原始細(xì)胞不高組的MDS患者CD56 陽(yáng)性率為53.85%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.05，P＞0.05）。原始細(xì)胞增高組和原始細(xì)胞不增高組：原始細(xì)胞CD56 陽(yáng)性率為27.27%、30.77%，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.05，P＞0.05）；粒細(xì)胞CD56 陽(yáng)性率為22.73%、15.38%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.28，P＞0.05）；單核細(xì)胞CD56 陽(yáng)性率為4.55%、7.69%,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.15，P＞0.05）。見表2。

表2 CD56 在MDS 中的表達(dá)情況（n）

2.3 AL 患者的染色體異常情況107 例AL 中檢出41 例存在染色體異常，染色體異常率約為38.32%。29 例CD56+的AL 患者19 例存在染色體異常；78例CD56-的AL 患者中檢出22 例存在染色體異常。在AL 患者中CD56+與CD56-的染色體異常檢出率為65.52%、28.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.45，P＜0.05）。29 例CD56+的AL 患者包括28 例AML和1 例T-ALL。28 例CD56+的AML 患者中可見到t（8;21）、-X、+8、t（9;22）、復(fù)雜核型、del（3-MLL）、+19 等細(xì)胞遺傳學(xué)改變，最常見的染色體異常是t（8;21）。即CD56+的AML 患者更易發(fā)生t（8;21）,多見于M2。見表3。

表3 28 例CD56+的 AML 患者染色體異常情況（n）

2.4 AL 患者中融合基因形成情況107 例AL 患者中檢出41 例存在融合基因，融合基因檢出率為38.32%。在29 例CD56+的AL 患者中檢出17 例存在融合基因，78 例CD56-的AL 患者中檢出24例存在融合基因，AL 患者中CD56+與CD56-融合基因檢出率為58.62%、30.77%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.94，P＜0.05）。28 例CD56+的AML 患者中可見到AML1/ETO、BCR/ABL、FLT3/ITD、WT1 等融合基因形成，AML1/ETO 融合基因在CD56+的AML 患者中的檢出率最高，為50.00%；主要見于AML-M2。即CD56+的AL 患者更易形成AML1/ETO 融合基因,多見于M2。見表4。

表4 28 例CD56+的AML 患者融合基因形成情況（n）

2.5 MDS 患者的染色體情況35 例MDS 患者中檢測(cè)出存在5q-、-7、20q-、+3q、+8、+18、+mar、t（13；21）、復(fù)雜核型（3 種及以上異常核型）等染色體異常，染色體異常檢出率為60.00%。CD56+的MDS患者中11 例存在染色體異常，IPSS 平均積分為8分。CD56-的MDS 患者中10 例存在染色體異常，IPSS 平均積分為5 分。CD56+的MDS 與CD56-的MDS 染色體異常檢出率為64.71%、55.56%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.31，P＞0.05）。影響預(yù)后的積分CD56+的MDS 患者高于CD56-的MDS 患者。見表5。

表5 35 例MDS 患者染色體情況（n）

3 討論

我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了107 例急性白血病和35 例MDS 患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD56 的表達(dá)情況，流式檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于可以同時(shí)用不同的抗體確定這些疾病中的不同細(xì)胞群,從而確定CD56 在不同細(xì)胞群上的表達(dá)情況。本研究發(fā)現(xiàn)107 例急性白血病患者中有29 例CD56 表達(dá)陽(yáng)性（＞20%）。CD56在AML-M2、AML-M5、T-ALL 的白血病細(xì)胞上均有不同程度表達(dá)，而CD56 更常表達(dá)于AML，且CD56在AML-M2 中的表達(dá)比其他類型急性白血病高。CD56 是區(qū)別AML 和ALL 的標(biāo)志之一。文獻(xiàn)報(bào)道[3]CD56 在AML 中的檢出率為13%～29%，其中主要在AML-M2、AML-M3、AML-M5、AML-M7 中 檢 出CD56 陽(yáng)性表達(dá)。本研究CD56 檢出率較國(guó)外報(bào)道稍高。有報(bào)道[12]稱CD56+的AML-M3 患者，多伴隨t（11；17），也可見t（15；17）。CD56+的AML-M3 患者盡管總體存活期無(wú)顯著差異,但緩解持續(xù)時(shí)間和無(wú)病生存期更短，預(yù)后、療效更差[13]。本研究未檢出M3 表達(dá)CD56，可能與樣本量有限有關(guān)。

MDS 是一種以一系或多系病態(tài)造血為特征的髓系腫瘤，具有向AL 轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險(xiǎn)。免疫分型在MDS 診斷和預(yù)后判斷中的作用逐漸被人們所肯定。CD56 在MDS 診斷、疾病進(jìn)展、預(yù)后判斷中的作用也不斷被認(rèn)可。MDS 診斷目前仍屬于排他性診斷，診斷MDS 尚無(wú)明確手段。流式細(xì)胞學(xué)是診斷MDS 的重要輔助性方法。選擇何種抗原來(lái)診斷MDS 及判定預(yù)后成為亟待解決的問(wèn)題。相關(guān)研究提示CD56在診斷MDS 及判斷預(yù)后方面具有重要參考價(jià)值。我們用流式檢測(cè)的方法更直觀地證明了CD56 可做為AL 和MDS 的惡性細(xì)胞分化的標(biāo)志。

CD56 異常表達(dá)常伴隨染色體和/或融合基因形成。即CD56 可預(yù)測(cè)融合基因和染色體情況。在AML 中CD56+多伴隨有t（8；21）和/或AML1/ETO融合基因形成。本研究MDS 染色體異常檢出率為60.00%，與文獻(xiàn)報(bào)道的40%～70%基本一致[10]，但是影響預(yù)后的積分，CD56+的MDS 患者高于CD56-的MDS 患者，CD56+的MDS 患者預(yù)后更差。Hu 等[14]報(bào)道盡管CD56 表達(dá)對(duì)無(wú)病存活率、總生存期無(wú)顯著影響，但是CD56+的AML 患者完全緩解率更低。我們發(fā)現(xiàn)CD56 異常表達(dá)時(shí)多存在細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的異常。檢測(cè)CD56 表達(dá)情況可能有利于疾病的療效觀察、疾病分層治療及預(yù)后判定。

在AL 和MDS 中CD56 常表達(dá)于原始細(xì)胞（早期階段細(xì)胞）。由于CD56 被廣泛認(rèn)為是惡性、具有侵襲性的標(biāo)志，所以在高度增殖的所有系列來(lái)源的異常細(xì)胞上均應(yīng)表達(dá)，但是CD56 似乎更常表達(dá)于原始細(xì)胞，其次為粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。該現(xiàn)象我們?cè)贏L 和MDS 病例中均有發(fā)現(xiàn)。在AL、MDS 中異常表達(dá)CD56 的原始細(xì)胞檢出率分別為75.86%、28.57%，均高于成熟粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。CD56+更常表達(dá)于原始細(xì)胞，可能與AL、MDS 中的原始細(xì)胞似乎更易發(fā)生惡變有關(guān)，MDS 中CD56 表達(dá)與原始細(xì)胞是否增高有關(guān)，具體機(jī)制有待繼續(xù)研究。

綜上所述，我們認(rèn)為CD56 作為診斷AML 和MDS 的重要標(biāo)志，可用于預(yù)后判斷，但在實(shí)際應(yīng)用中仍需進(jìn)一步研究。