李德新　李華　李飛　趙曉晨　李茂德　安祥　蘭戴天

摘要：目的 ?探討不同程度CDCA5表達在裸鼠肝細胞癌中的作用及臨床價值。方法 ?取HepG2正常細胞組、CDCA5低表達組、CDCA5高表達組、HepG2肝癌細胞株，將高表達組、低表達組CDCA5高效轉染人肝癌HepG2細胞，并設陰性對照組（NC組）。免疫印跡法檢測轉染24 h后各組CDCA5蛋白的表達水平，CCK-8法檢測轉染24、48、72、96、120 h 各組細胞的增殖能力，Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測低表達組轉染48 h的凋亡情況;將HepG2正常細胞組，CDCA5低表達組的細胞分別注射于裸鼠成瘤，觀察成瘤時間，第30天處死小鼠，觀察瘤體狀態(tài)。免疫組化檢測CDCA5在裸鼠腫瘤中的表達。結果 ?高表達和低表達組的CDCA5蛋白水平均高于NC組（P<0.05）;自轉染48 h起，高表達組和低表達組的相對增殖率均高于NC組（P<0.05）;高表達組和低表達組轉染72 h后的相對增殖率分別為（130.03±0.35）%和（70.10±1.04）%，均高于其他觀察時間點（P<0.05）;低表達組轉染48 h的早期和晚期凋亡率均高于NC組（P<0.05）;裸鼠皮下注射普通HepG2細胞組及CDCA5低表達HepG2細胞，瘤體重量分別為（0.93±0.06）g、（0.69±0.10）g，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;CDCA5在低表達組裸鼠腫瘤組織中表達降低。結論 ?CDCA5能促進HepG2癌細胞的增殖，可通過調控CDCA5表達水平，有效抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡。

關鍵詞：CDCA5;肝癌;裸鼠;預后

中圖分類號：R735.7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.18.015

文章編號：1006-1959（2020）18-0048-03

The Role and Clinical Value of CDCA5 in Nude Mice Hepatocellular Carcinoma

LI De-xin，LI Hua，LI Fei，ZHAO Xiao-chen，LI Mao-de，AN Xiang，LAN Dai-tian

（Sichuan Academy of Medical Sciences/Hepatobiliary Surgery，Sichuan Provincial People's Hospital，

Chengdu 610010，Sichuan，China）

Abstract：Objective ?To explore the role and clinical value of different levels of CDCA5 expression in nude mice hepatocellular carcinoma.Methods ?HepG2 normal cell group， CDCA5 low expression group， CDCA5 high expression group and HepG2 hepatocarcinoma cell lines were selected. The high expression group and low expression group CDCA5 were efficiently transfected into human liver cancer HepG2 cells， and a negative control group （NC group） was established. Western blotting was used to detect the expression level of CDCA5 protein in each group after 24 h of transfection. CCK-8 method was used to detect the proliferation ability of cells in each group after transfection 24， 48， 72， 96， 120 h. Annexin V-FITC/PI double label flow Cytometry was used to detect the apoptosis of the low expression group for 48 h after transfection; the HepG2 normal cell group and the CDCA5 low expression group were injected into nude mice to form tumors， and the tumor formation time was observed. The mice were killed on the 30th day and the tumors were observed body state. Immunohistochemistry was used to detect the expression of CDCA5 in tumors of nude mice.Results ?The CDCA5 protein levels of the high and low expression groups were higher than those of the NC group （P<0.05）; since 48 h after transfection， the relative proliferation rates of the high and low expression groups were higher than those of the NC group （P<0.05）; The relative proliferation rates of high expression group and low expression group 72 h after transfection were （130.03±0.35）% and （70.10±1.04）%， respectively， which were higher than other observation time points （P<0.05）; low expression group was transfected the early and late apoptosis rates at 48 h were higher than those in the NC group （P<0.05）; the nude mice were subcutaneously injected with ordinary HepG2 cells and CDCA5 low-expressing HepG2 cells， and the tumor weights were （0.93±0.06） g and （0.69±0.10）g， the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression of CDCA5 in the tumor tissues of nude mice in the low expression group decreased.Conclusion ?CDCA5 can promote the proliferation of HepG2 cancer cells， and could effectively inhibit the proliferation of liver cancer cells and promote their apoptosis by regulating the expression level of CDCA5.

Key words：CDCA5;Liver cancer;Nude mice;Prognosis

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，患者就診時往往病情嚴重、預后較差，病死率高，目前主要以手術治療、放療、化療、生物治療等綜合治療為主[1]。研究發(fā)現，腫瘤的發(fā)生與細胞周期具有重要的相關性，對腫瘤細胞周期異常蛋白的調控成為治療靶點。CDCA5在多種腫瘤組織中表達均增加[2-4]，這提示CDCA5在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中可能起到重要的作用。本研究通過CDCA5細胞實驗、裸鼠成瘤實驗，探討低表達CDCA5在肝癌細胞中的功能，試圖尋找生物治療新的方向提供參考。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器 ?收集HepG2正常細胞組，CDCA5低表達組，CDCA5高表達組，HepG2肝癌細胞株，DMEM 高糖培養(yǎng)基，10%胎牛血清和25%胰蛋白酶，小鼠抗CD-CA5抗體，小鼠抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體，電泳、電轉裝置，BCA蛋白定量試劑盒購，免疫印跡化學發(fā)光劑，ECL流式細胞儀，慢病毒pSICOR、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，DNA凝膠回收試劑盒，青鏈霉，PBS，碘化丙啶，菌種DH5α由本實驗室保存。

1.2細胞培養(yǎng) ?SMMC-7721、HepG2細胞 用含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，行轉染實驗。

1.3實驗動物 ?SPF級BAlB/C-nu/nu裸小鼠，4～6周齡，體重18～20 g，購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，在SPF級動物房內飼養(yǎng)。

1.4 Western blotting檢測各組CDCA5蛋白表達水平 ?細胞轉染24 h后提取高表達組、低表達組、NC組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調整為2 μg/μl，取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳（5%濃縮膠60 V×40 min，10%分離膠100 V×60 min），4 ℃200 mA恒流轉膜1 h，室溫封閉1 h，分別加CDCA5一抗（1∶1000）、GAPDH一抗（1∶2000），4 ℃過夜，二抗（1∶5000）室溫孵育1 h。將PVDF膜置于 ECL中反應，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像，應用Quantity one進行灰度分析，蛋白相對表達量用CDCA5灰度值與內參 GAPDH 的比值計算。

1.5 CCK-8 法檢測細胞增殖 ?細胞轉染24 h制作單細胞懸液，將細胞接種于96孔板，設3個復孔，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72、96 h，加入 CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，取450 nm波長處檢測每孔的吸光值（A），相對增殖率（%）=各組A/NC組A×100%計算。

1.6檢測細胞凋亡水平 ?各組細胞轉染48 h制作單細胞懸液，將細胞移入離心管，離心5 min，棄上清，PBS溶液洗滌，收集提取重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC 4 ℃孵育15 min，加入5 μl PI混勻孵育15 min，經流式細胞儀檢測分析細胞凋亡率。

1.7檢測CDCA5在裸鼠腫瘤中的表達 ?將HepG2細胞接種于培養(yǎng)皿中，用慢病毒pSICOR、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro感染，收集HepG2正常細胞組，CDCA5低表達組，CDCA5高表達組對數期細胞，調整細胞懸液濃度，用0.25%的胰酶消化轉移至流式細胞管并計數，用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度1×107個/ml。每只小鼠皮下注射0.2 ml，自接種之日起每天觀察裸鼠狀態(tài)，成瘤時間及瘤體生長情況。第30天處死裸鼠，取出腫瘤，稱重并計算每組腫瘤的平均瘤重。

1.8統(tǒng)計學方法 ?采用SPSS軟件IBM version 22.0進行處理，計量資料的表示采用（x±s）表示，多組計量數據間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，非正態(tài)分布采用Mann-Whitney U檢驗，Kaplan-Meier法計算患者的累積無瘤生存率（RFS）及總生存率（OS）。采用Log-rank法進行單因素分析，比較生存時間的差異。采用雙側檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 CDCA5在肝癌細胞株的表達 ?HepG2肝癌細胞株CDCA5蛋白表達量最高，SMMC-7721細胞株CDCA5蛋白表達量最低，構建敲低及高表達CDCA5的質粒，Western blot檢測敲低及過表達CDCA5后的變化。對照組、陰性對照組、CDCA5低表達組、CDCA5高表達組蛋白相對表達量分別為（0.59±0.14）、（0.56±0.16）、（0.06±0.02）、（0.77±0.11），組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;另外，低表達組的表達量最低，抑制效率最高，與各組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2肝癌細胞增殖 ?檢測低表達和高表達細胞生長增殖情況，生長情況以NC組作對照，轉染 24 h后與空白組相對增殖率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），轉染48、72 h后，低表達組HepG2細胞抑制率分別為（65.97±0.58）%、（70.10±1.04）%。隨著轉染時間延長肝癌細胞增殖率受抑制;高表達組HepG2細胞存活率分別為（128.93±0.95）%、（130.03±0.35）%。隨著轉染時間延長，肝癌細胞存活率逐漸增強，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3細胞凋亡情況 ?低表達組轉染48 h的早期和晚期凋亡率分別為（19.43±2.31）%、（24.37±2.21）%均高于對照組的（4.30±0.73）%、（6.13±1.58）%及陰性對照組的（4.43±0.36）%、（6.67±2.91）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。陰性對照組與對照組早期和晚期凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.4成瘤動物實驗檢測 ?裸鼠皮下分別注射普通HepG2細胞及CDCA5低表達HepG2細胞，對照組第6天出現腫瘤，CDCA5低表達組第7天出現腫瘤。瘤體逐漸增大，直至第30天對照組瘤體重量分別為（0.93±0.06）g，CDCA5低表達組（0.69±0.10）g，隨著時間推移對癥組瘤體重量高于CDCA5低表達組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.5免疫組化檢測CDCA5 ?對照組、低表達組織中CDCA5蛋白的陽性表達率分別為 86.5%、31.8%，在低表達組裸鼠腫瘤組織中CDCA5陽性率限制降低，見圖2。

3討論

原癌基因激活、抑癌基因失活、相關基因表達異常、細胞增殖和凋亡能力失常、生長因子和受體異常表達等導致肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展[5，6]。臨床研究顯示細胞增殖及凋亡失控是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要機制[7]。細胞周期蛋白表達異常尤為突出，因此調節(jié)和抑制細胞周期蛋白酶，可介導腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展，延緩或終止腫瘤組織形成。本研究發(fā)現，CDCA5在HCC癌及裸鼠成瘤組織中表達量升高，提示可以通過調控CDCA5干預肝癌的形成。相關研究提示CDCA5可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。對于CDCA5功能的研究比較缺乏。本研究結果顯示隨著轉染時間延長，肝癌細胞存活率增強，通過CDCA5低表達觀察在肝癌HepG2細胞和裸鼠成瘤中發(fā)生發(fā)展的功能進一步探討。

既往部分研究提示CDCA5可預測癌癥患者的預后。在尿路上皮細胞癌、口腔鱗癌、非小細胞肺癌中的研究發(fā)現，CDCA5高表達與總生存率、局部或是全身復發(fā)、預后具有密切聯系，可認為是其危險因素[8，9]。本研究中低表達組轉染48h的早期和晚期凋亡率分別為（19.43±2.31）%、（24.37±2.21）%，均高于對照組。此外我們，發(fā)現CDCA5 陽性表達率越高，腫瘤分化程度越差，這表示CDCA5具有加速肝癌細胞分裂，參與肝癌發(fā)生發(fā)展機制 ，從而導致腫瘤惡性程度增高，在裸鼠成瘤動物實驗得到進一步證實。

肝癌分期把腫瘤直徑作為一個獨立危險因素，評估患者預后。本研究通過裸鼠皮下注射普通HepG2細胞及CDCA5低表達HepG2細胞，兩者具有統(tǒng)計學差異。敲低CDCA5裸鼠腫瘤組織直徑較小，生長周期延長，說明調控CDCA5的表達對腫瘤的預后具有一定的作用。但只以腫瘤直徑判斷預后具有局限性，需結合腫瘤生物學特性，從而讓腫瘤直徑指標對患者預后更有價值。

總之，本實驗通過調控CDCA5 表達水平，有效抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡。從而對肝癌基因靶向治療初步提供了一個新的方向，CDCA5的異常增高有望成為肝細胞癌早期診斷和病情判斷的一項參考指標，就CDCA5在肝癌中的特異性及信號通路可作為突破口。

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收稿日期：2020-05-25;修回日期：2020-06-16

編輯/錢洪飛

基金項目：四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院2017年院科研基金資助項目（編號：2017LY19）

作者簡介：李德新（1983.11-），男，四川成都人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肝膽胰腺疾病的基礎與臨床研究

通訊作者：李華（1985.7-），女，四川廣安人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腹部及心臟超聲診斷工作