孫 博，霍華珍，蔡愛華，謝運昌，李典鵬**

(1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林 541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西桂林 541006)

0 引言

大果山楂為薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物臺灣林檎Malusdoumeri(Bois) Chev.和光萼林檎MalusleiocalycaSZ.Huang.的干燥成熟果實，但實際生產(chǎn)中的樹種均為臺灣林檎[1]。大果山楂主要分布于我國的中部和南部地區(qū)[2]，是廣西重要的經(jīng)濟作物，具有80多年的栽培史。在政府扶貧項目的扶持下，廣西逐步發(fā)展成為大果山楂的主產(chǎn)地。據(jù)1990年版《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》記載，大果山楂果實性味甘、酸、澀、微溫，有理氣健脾和消食導(dǎo)滯功效[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明大果山楂具有開胃助消化、降血脂、消炎抗菌及抗腫瘤效果[4]。大果山楂具有果大、氣味清香、酸甜適中的特點，是制作山楂糕、山楂片、蜜餞等傳統(tǒng)食品的原料[5]，因此大果山楂具有較強的市場生命力，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，在植物體中主要以糖苷形式存在，具有多種生物活性，在抗氧化、防癌和抑制脂肪酶活性等方面具有明顯作用[6]。大果山楂因富含黃酮類物質(zhì)而具有抗氧化、清除自由基和抗衰老等功效[7-9]。目前對單一產(chǎn)地或品種的大果山楂化學(xué)成分和藥理作用等方面的研究較多[10]，對不同產(chǎn)地大果山楂果實總黃酮含量及其抗氧化活性的報道較少[7,11-12]。已發(fā)表的關(guān)于大果山楂總黃酮含量的測定方法主要為高效液相色譜法[7]和可見分光光度法[12]。與高效液相色譜法相比，可見分光光度法具有適用性較廣、操作簡單、測試時間短、精密度高和準(zhǔn)確度較好等特點。因此，本文以10種產(chǎn)地的大果山楂鮮果為研究對象，采用可見分光光度法測定總黃酮含量，并測定其對DPPH自由基的清除能力和氧自由基的吸收能力，以期為大果山楂原料和產(chǎn)品的質(zhì)量控制，以及功能性食品的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年10月采摘來自于廣西、廣東10種不同地方的成熟大果山楂鮮果，經(jīng)李典鵬研究員鑒定均為臺灣林檎Malusdoumeri(Bois) Chev.果實，各樣品編號及產(chǎn)地信息如下：M1，廣西天峨縣；M2，廣西柳江區(qū)；M3，廣西德?？h；M4，廣西靖西市；M5，廣西長洲區(qū)；M6，廣西昭平縣；M7，廣西鐘山縣；M8，廣西平樂縣；M9，廣西恭城縣；M10，廣東信宜市。選擇沒有病蟲害、無機械損傷且成熟度基本一致的大果山楂，在4℃條件下貯藏備用。

1.2 試劑

蘆丁、水溶性維生素E類似物Trolox(純度≥98%，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(分析純，西隴化工股份有限公司)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(純度≥97%，福州飛凈生物科技有限公司)，2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸(ABAP，分析純，濟南榮正化工有限公司)，熒光素鈉(分析純，西安百螢生物科技有限公司)。試驗用水為實驗室自制超純水。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)，T6紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，XS205分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，RIOS 8超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，100—1 000 μL Finnpipette F1移液器(美國Thermo Fisher公司)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，LHS智能恒溫恒濕箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，HH-S4恒溫水浴鍋(上海況勝實業(yè)發(fā)展有限公司)，N1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海艾朗儀器有限公司)，超聲波清洗機(深圳福洋科技集團有限公司)，Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀(上海帝肯貿(mào)易有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 大果山楂總黃酮的提取

參考大果山楂鮮果總黃酮回流提取法[11]和超聲提取法[13]，稍作改進(jìn)，使用兩種方法提取大果山楂總黃酮。

回流提取法：以廣西天峨縣大果山楂為原料，稱取10 g鮮果勻漿，在提取溶劑為70%乙醇、提取溫度70℃、料液比1∶18 (g/mL)的條件下，回流提取2 h，抽濾，并重復(fù)提取3次，濾液合并減壓濃縮后用70%乙醇定容至100 mL，平行試驗3次。

超聲提取法：以廣西天峨縣大果山楂為原料，稱取10 g鮮果勻漿，在提取溶劑為70%乙醇、料液比1∶18 (g/mL)、超聲功率300 W的條件下，超聲提取40 min，抽濾，重復(fù)提取3次，濾液合并減壓濃縮后用70%乙醇定容至100 mL，平行試驗3次。

1.4.2 溶液的制備

(1)對照品溶液的制備：精密稱取5.00 mg蘆丁對照品，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，得0.20 mg/mL蘆丁對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備：隨機取各產(chǎn)地大果山楂果實勻漿10 g，在提取溶劑為70%乙醇、料液比1∶18 (g/mL)、超聲功率300 W的條件下，超聲提取40 min，抽濾，重復(fù)提取3次，濾液合并減壓濃縮后用70%乙醇定容至100 mL。

1.4.3 可見分光光度法方法學(xué)考察

以蘆丁為對照品，采用可見分光光度法對大果山楂總黃酮的含量進(jìn)行測定。

(1)溶液顯色方法

參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。取適量1.4.2節(jié)中的待測供試品溶液置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇至10 mL，接著再加入1 mL 5%亞硝酸鈉，混勻，放置6 min；然后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min；再加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后加入50%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后在510 nm波長處測定吸光度。

(2)線性關(guān)系

分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3節(jié)步驟(1)進(jìn)行顯色，以相應(yīng)試劑為空白，在510 nm波長處測定吸光度，以反應(yīng)體系蘆丁含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)精密度試驗

精密吸取1.4.2節(jié)制備的供試品溶液0.3 mL，置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3節(jié)步驟(1)進(jìn)行顯色，顯色后平行6次測定吸光度。

(4)穩(wěn)定性試驗

精密吸取1.4.2節(jié)制備的供試品溶液0.3 mL，置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3節(jié)步驟(1)進(jìn)行顯色，顯色后于 0，15，30，45，60 min時測定吸光度。

(5)重復(fù)性試驗

精密稱取同一個產(chǎn)地大果山楂果實勻漿6份，按1.4.2節(jié)方法進(jìn)行供試品溶液的制備，取0.3 mL該溶液，置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3節(jié)步驟(1)進(jìn)行顯色，顯色后測定各溶液的吸光度。

(6)大果山楂總黃酮含量測定

精密吸取0.3 mL 1.4.1節(jié)提取的總黃酮提取液和1.4.2節(jié)制備的供試品溶液，參照1.4.3節(jié)步驟(1)進(jìn)行顯色，在510 nm波長處測定吸光度并計算其總黃酮含量，每個樣品平行測定6次(n=6)。總黃酮(mg/g)=大果山楂提取液中總黃酮含量(mg)/大果山楂鮮果取樣質(zhì)量(g)。

(7)加樣回收率試驗

取總黃酮含量已知的大果山楂勻漿，加入一定量的蘆丁對照品，按1.4.2節(jié)方法制備樣品溶液6份，按1.4.3節(jié)步驟(1)顯色后測定吸光度。

1.4.4 大果山楂黃酮提取液體外抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[15-17]方法，稍作修改。分別精密量取2.0 mL 1.4.2節(jié)供試品溶液稀釋后所得的各濃度黃酮溶液 (0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)，與2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH 溶液混合搖勻，于室溫下靜置反應(yīng)20 min，作為樣品溶液。用95%乙醇調(diào)零，樣品放入吸收池中，在517 nm處測定吸光度(A1)。使用相同體積的95%乙醇代替DPPH溶液(為對照組)，按上述條件混合和靜置反應(yīng)，測定其在517 nm 處的吸光度(A0)?？瞻捉M為2 mL 95%乙醇+2 mL DPPH溶液，按上述方法測定其在517 nm處的吸光度(A2)，以水溶性維生素E類似物Trolox為陽性對照物(濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)，平行測定3次，計算DPPH清除率，DPPH清除率(%)=[1— (A1—A2)/A0]×100%。不同產(chǎn)地大果山楂黃酮提取液對DPPH的清除能力，用半數(shù)清除濃度IC50表示。根據(jù)DPPH清除率，運用SPSS 19.0 進(jìn)行Probit回歸分析，計算10種產(chǎn)地大果山楂總黃酮提取液對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)，IC50值越小說明清除自由基的能力越強[18]。

(2)氧自由基吸收能力(ORAC)的測定

參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行ORAC的測定。標(biāo)準(zhǔn)品Trolox需配制成系列濃度(6.25，12.50，25，50 μmol/L)的溶液。配制75 mmol/L pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。待測樣品用磷酸鹽緩沖溶液稀釋。具體操作步驟如下：在 96孔黑色底部透明微孔板相應(yīng)的微孔中分別加入20 μL磷酸鹽緩沖溶液(空白對照)或抗氧化物質(zhì)(Trolox或待測樣品)，37℃下暗處反應(yīng)10 min；然后加入200 μL熒光工作液(熒光素鈉)，在37℃下反應(yīng)20 min；隨后迅速在各個微孔中加入 20 μL自由基誘發(fā)劑ABAP 溶液，在多功能酶標(biāo)儀中連續(xù)測定其熒光強度的變化(37℃，每5 min測定一次，總時長為150 min，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為538 nm)。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有樣品都進(jìn)行3次平行試驗。 根據(jù)抗氧化劑作用下的熒光熄滅曲線下面積(AUC)與空白對照孔(無抗氧化劑)自由基的AUC，計算抗氧化劑的熒光保護(hù)面積，即熒光熄滅曲線的延遲部分面積(Net AUC)。Net AUC的計算公式為Net AUC= AUCsample-AUCblank。根據(jù)Trolox濃度和Net AUC之間的回歸方程來計算 ORAC值，并表示為每克樣品(鮮質(zhì)量)的Trolox當(dāng)量[mg Trolox equivalents (TE)/g FW]。ORAC值越大，說明大果山楂黃酮提取液對氧自由基的吸收能力越強，其抗氧化活性越高[7]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

線性關(guān)系試驗中蘆丁濃度與吸光值間的回歸方程為y=11.184x+0.0085，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3；蘆丁質(zhì)量濃度在0.008—0.064 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。重復(fù)性試驗中吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.81%，表明該方法重復(fù)性良好；精密度試驗中吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.46%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.14%，表明總黃酮溶液在顯色后60 min內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性；加樣回收率試驗中平均加樣回收率為99.78%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.07%，表明該方法適合大果山楂總黃酮含量的檢測。

2.2 大果山楂總黃酮提取方法的確定

將回流提取和超聲提取的天峨縣大果山楂進(jìn)行總黃酮含量測定，回流提取法提取大果山楂總黃酮的平均得率為2.18%，超聲提取法提取大果山楂總黃酮的平均得率為2.16%，結(jié)果表明兩種方法的得率差異甚微。超聲波具有空化、機械、熱效應(yīng)、乳化、擴散等效應(yīng)，能使植物細(xì)胞壁破裂，加速大果山楂有效成分的釋放、溶解及擴散；且提取溫度低、時間短、提取效率高，因此選擇超聲提取法作為大果山楂總黃酮的提取方法。

2.3 大果山楂總黃酮含量

如表1所示，10種不同產(chǎn)地的大果山楂總黃酮含量為16.87—38.61 mg/g，其中廣西靖西市的大果山楂總黃酮含量最高為(38.61±0.25) mg/g，約為廣西德?？h大果山楂總黃酮含量(16.87±0.22) mg/g的2.3倍。10種產(chǎn)地大果山楂總黃酮含量由高到低依次為M4(廣西靖西市)> M10(廣東信宜市)> M8(廣西平樂縣)> M6(廣西昭平縣)> M9(廣西恭城縣)> M7(廣西鐘山縣)>M1(廣西天峨縣)>M5(廣西長洲區(qū))>M2(廣西柳江區(qū))>M3(廣西德?？h)。統(tǒng)計分析表明不同產(chǎn)地大果山楂總黃酮含量存在顯著差異(P<0.05)。不同產(chǎn)地大果山楂總黃酮含量差異顯著的原因可能與采收時間、栽培方式、品種和產(chǎn)地等因素有關(guān)。由于取樣的局限性，本實驗所收集的品種并不能完全代表各產(chǎn)地的質(zhì)量差異，如深入研究則應(yīng)進(jìn)一步對其他成分或品種產(chǎn)地進(jìn)行分析。

表1 10種不同產(chǎn)地大果山楂樣品的總黃酮含量(n=6)

2.4 大果山楂總黃酮提取液體外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

實驗表明DPPH自由基清除率隨著總黃酮濃度增加而增大，在一定范圍內(nèi)具有明顯的量效關(guān)系，而當(dāng)濃度超過0.1 mg/mL后量效關(guān)系體現(xiàn)不明顯，這與黃欣欣[19]的研究結(jié)果一致。如表2所示，10種產(chǎn)地大果山楂總黃酮提取液對DPPH自由基均有較好的清除能力。廣西靖西市大果山楂總黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力是10個樣品中最強的，且略強于陽性對照Trolox，其半數(shù)清除濃度IC50=(0.048±0.006) mg/mL，其次為廣東信宜市大果山楂I(xiàn)C50=(0.055±0.004) mg/mL，清除能力最弱的是廣西天峨縣大果山楂I(xiàn)C50=(0.059±0.007) mg/mL。各大果山楂總黃酮提取液對DPPH自由基清除能力(IC50)無顯著差異(P>0.05)。

2.4.2 氧自由基吸收能力(ORAC)

從表3可知，不同產(chǎn)地大果山楂總黃酮提取液氧自由基吸收能力最強的是廣西靖西市(39.35±0.42)mg TE/g FW，其次是廣東信宜市(33.68±0.54)mg TE/g FW，最弱的是廣西天峨縣(24.06±0.74)mg TE/g FW，而且10種產(chǎn)地大果山楂總黃酮提取液的ORAC值存在顯著差異(P<0.05)。 另外，ORAC值與大果山楂總黃酮含量趨勢并不完全一致，一方面可能是各產(chǎn)地大果山楂果實含有的黃酮類化合物組成和含量不同導(dǎo)致的；另一方面在大果山楂總黃酮提取過程中不可避免地會有其他酚類[7]或維生素[9]等成分浸出，如綠原酸[20]、肉桂酸[21]和維生素C[22]等，這些成分組成和含量的差異也會影響總黃酮提取液的抗氧化活性。因此要全面掌握大果山楂果實抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，需對大果山楂果實中各類組成成分及含量進(jìn)行深入分析。

表2 10種不同產(chǎn)地大果山楂黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力(n=3)

表3 10種不同產(chǎn)地大果山楂黃酮提取液氧自由基吸收能力 (n=3)

3 結(jié)論

超聲提取法提取大果山楂總黃酮的效果優(yōu)于回流提取法，經(jīng)方法學(xué)考察結(jié)果表明可見分光光度法適用于大果山楂總黃酮含量的測定。10種產(chǎn)地大果山楂總黃酮含量存在顯著差異(P<0.05)，其中廣西靖西市大果山楂總黃酮含量最高。另外，10種產(chǎn)地大果山楂總黃酮均具有良好的DPPH自由基清除能力和氧自由基吸收能力，因此可作為抗氧化劑的重要來源，但其具體的抗氧化活性成分還不明確，有待進(jìn)一步探究。后續(xù)可考慮利用HPLC指紋圖譜對大果山楂黃酮類及其他抗氧化物質(zhì)進(jìn)行全面的定性和定量分析，以期為大果山楂的原料和產(chǎn)品質(zhì)量控制及食品、保健品等領(lǐng)域的開發(fā)利用提供更為科學(xué)的理論支撐。