郭麗君，唐鳳鸞，趙 健

(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實驗室，廣西桂林 541006)

0 引言

走馬胎(Ardisiagigantifolia)為紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛屬(Ardisia)常綠直立小灌木，是我國傳統(tǒng)的中草藥，有消腫止痛、祛風(fēng)活血等功效[1-2]。走馬胎富含三萜皂苷類化合物和巖白菜素衍生物等有效成分[3-5]，藥效確切，應(yīng)用面廣，市場需求大，但野生資源匱乏[6]。采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行走馬胎種苗生產(chǎn)，可同時滿足市場需求和資源保護(hù)[2,7]兩方面的要求。誘導(dǎo)頂芽或側(cè)芽萌發(fā)形成再生植株的方式，能較好地保持親本材料的優(yōu)良性狀[8]，但繁殖速度可能不及誘導(dǎo)叢生芽；而通過誘導(dǎo)葉片或愈傷組織可形成大量叢生芽，大幅提高繁殖速度，但經(jīng)過脫分化的培養(yǎng)材料變異風(fēng)險增加；同時在植物組織培養(yǎng)過程中，通常會出現(xiàn)材料生長不一致現(xiàn)象，導(dǎo)致材料外觀形態(tài)不同，這種現(xiàn)象使不同物種的后續(xù)培養(yǎng)表現(xiàn)出較大差異。因此，研究走馬胎不同類型材料對增殖和生根的影響，對促進(jìn)走馬胎組培苗規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。

已有文獻(xiàn)對走馬胎組織培養(yǎng)進(jìn)行了報道。唐鳳鸞等[9]、蔡時可等[10]和王強(qiáng)等[11]以走馬胎幼苗嫩莖為材料，分別通過腋芽增殖的方式進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)，前兩者篩選出的最適培養(yǎng)基分別為MS培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基和1/2 MS培養(yǎng)基，兩者的培養(yǎng)基成分及濃度均有差異，后者篩選出的最適培養(yǎng)基分別為木本植物用培養(yǎng)基(WPM培養(yǎng)基)、WPM培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基。符運(yùn)柳等[7]采用走馬胎嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織后分化形成的不定芽進(jìn)行繼代增殖和生根培養(yǎng)，均篩選出最適MS培養(yǎng)基，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基與唐鳳鸞等[9]的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基僅6-芐氨基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的濃度不同；而與蔡時可等[10]的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基6-BA的濃度相同，但其他植物生長激素和濃度均不同；其MS生根培養(yǎng)基與蔡時可等[10]的1/2 MS培養(yǎng)基中激素均為NAA和吲哚乙酸(IBA)，但濃度均不同；使用到的其他培養(yǎng)基在成分及濃度上與其均有差異。前人對走馬胎組培快繁的研究主要集中在腋芽、不定芽增殖和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件篩選及優(yōu)化，而針對走馬胎誘導(dǎo)萌發(fā)后，不同類型材料的繼代增殖和生根特征研究卻未見報道。本研究分析走馬胎3種不同類型材料繼代增殖和生根培養(yǎng)各指標(biāo)的特征，然后采用隸屬函數(shù)法對各指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，進(jìn)一步豐富走馬胎的組織培養(yǎng)技術(shù)，為走馬胎的種苗繁育及生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為以桂林周邊地區(qū)野生走馬胎植株的幼嫩枝條為親本，經(jīng)啟動、增殖培養(yǎng)獲得的無菌瓶苗。以生長健壯、葉片寬厚、色澤純正的植株莖段即腋芽為材料1；誘導(dǎo)無菌瓶苗健康幼嫩葉片形成的不定芽為材料2；增殖培養(yǎng)過程中出現(xiàn)頻率相對較高、葉片細(xì)長、葉色偏淺的植株莖段為材料3。將3類材料剪成長2—3 cm、帶1—2個腋芽的莖段，繼代增殖培養(yǎng)時材料不帶葉片，生根培養(yǎng)時材料帶1—2片半張葉，備用。

1.2 方法

將材料分別接種于繼代培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)和生根培養(yǎng)基(1/2 MS+1.5 mg/L IAA+1.0 mg/LNAA)中，培養(yǎng)基附加30 g/L蔗糖和6.0 g/L瓊脂，pH值為5.5—6.0[9]，每個處理接種20瓶，每瓶接種15個莖段，平行3次。培養(yǎng)室光源采用光照強(qiáng)度為40—60 μmol/(m2·s)的日光燈，光照時間為12 h/d，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃。

接種50 d后，對繼代材料的苗高、鮮質(zhì)量、莖節(jié)長、增殖系數(shù)、葉片長和寬，以及生根材料的生根率、主根數(shù)、根長、苗高、葉片長和寬等參數(shù)進(jìn)行測量記錄。平均苗高=莖長總和/苗數(shù)，莖節(jié)長選取苗中部1—2節(jié)進(jìn)行測定，增殖系數(shù)=增殖后苗數(shù)(株)/增殖前苗數(shù)(株)，生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種苗總數(shù))×100%，主根數(shù)為苗莖基部長出的根條數(shù)，平均根長=主根總長度/總根數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2013和SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法[12]綜合評價走馬胎不同類型材料對種苗組培中增殖與生根的影響，各指標(biāo)均采用隸屬函數(shù)公式計算其函數(shù)值，并賦予相同的權(quán)重值。隸屬函數(shù)值U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中i為測定因子，i=(1,2，…，n)，Xi為第i個因子的測定值，Xmax和Xmin分別為所有參試材料的第i個因子的最大值和最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 繼代增殖特征

走馬胎不同類型材料繼代增殖培養(yǎng)的各項指標(biāo)間的差異比較明顯。從表1可以看出，苗高度依次為材料1>材料3>材料2，其余指標(biāo)均為材料1>材料2>材料3。材料1的增殖系數(shù)分別是材料2和材料3的1.18倍和1.48倍，苗高為1.86倍和1.78倍，鮮質(zhì)量為1.98倍和4.74倍，莖節(jié)長為1.79倍和1.98倍，葉片長為1.19倍和1.90倍，葉片寬為1.06倍和2.24倍。材料1的增殖系數(shù)與材料3差異顯著，而材料2和材料3間差異不顯著；材料1的苗高、莖節(jié)長與其他材料差異顯著，3類材料間鮮質(zhì)量均差異顯著；材料3葉片長、寬與材料1、材料2均差異顯著，而材料1和材料2差異不顯著。材料1的植株莖干粗壯，葉大且多，色澤純正，生長良好；材料2莖略細(xì)，葉較大且較多，莖葉色澤純正；材料3莖細(xì)弱，莖色較淺，葉片細(xì)小且少，葉色偏淺(圖1)。

表1 走馬胎不同類型材料組培苗繼代增殖的各指標(biāo)比較

圖1 走馬胎繼代增殖組培苗

2.2 生根培養(yǎng)特征

由表2可以看出，走馬胎不同類型材料組培苗生根率、主根數(shù)、葉片長和寬的大小排序均為材料1>材料2>材料3，苗高排序依次為材料1>材料3>材料2，根長排序依次為材料2>材料1>材料3。材料1的生根率為93.89%，分別是材料2和材料3的1.39倍和1.75倍，苗高為1.42倍和1.19倍，主根數(shù)為1.15倍和1.26倍，葉片長為1.41倍和1.63倍，葉片寬為1.30倍和2.07倍。3類材料的生根率和葉片寬均差異顯著，材料1的苗高和葉片長與材料2差異顯著，而其葉片長與材料3差異顯著，但3類材料的主根數(shù)均差異不顯著。

材料1的主根多，數(shù)量為3—5條；側(cè)根較少且較短，數(shù)量2—15條，長0.1—2.0 cm；莖粗壯，葉大且多，莖葉色澤純正。材料2的主根較多，數(shù)量為3—4條；側(cè)根多且較長，數(shù)量6—25條，長0.1—3.0 cm；莖略細(xì)，葉較大，數(shù)量少，莖葉色澤純正。材料3的主根少，數(shù)量為2—3條；側(cè)根少且短，數(shù)量1—2條，長0.1—0.5 cm；莖細(xì)弱且莖色偏淺，葉小且較少，葉色偏淺(圖2)。

表2 走馬胎不同類型材料組培苗生根培養(yǎng)的各指標(biāo)比較

圖2 走馬胎生根組培苗

2.3 增殖與生根的綜合評價

3種走馬胎材料組培苗增殖與生根的各指標(biāo)綜合評價結(jié)果表明，隸屬函數(shù)平均值排序均為材料1>材料2>材料3，即為綜合評價排序。繼代增殖各指標(biāo)隸屬函數(shù)值均為材料1最高；生根培養(yǎng)指標(biāo)除根長的隸屬函數(shù)值為材料1低于材料2外，其他各指標(biāo)隸屬函數(shù)值均為材料1最高。除苗高外，材料3的其他指標(biāo)隸屬函數(shù)值均為材料1最低(表3-4)。

表3 走馬胎不同類型材料組培苗繼代增殖的各指標(biāo)加權(quán)隸屬函數(shù)值

表4 走馬胎不同類型材料組培苗生根培養(yǎng)的各指標(biāo)加權(quán)隸屬函數(shù)值

3 討論

組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物種苗繁育。前人主要側(cè)重于快速繁殖體系的建立及培養(yǎng)基的優(yōu)化[7-11,13-15]，對增殖和生根誘導(dǎo)材料的比較研究未見報道。本研究以腋芽、葉片誘導(dǎo)不定芽和葉片細(xì)小莖段為培養(yǎng)材料，對走馬胎組培苗增殖和生根特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在走馬胎的繼代增殖中，腋芽各指標(biāo)數(shù)值均為最大值，為其他材料的1.5倍以上，其中鮮質(zhì)量和葉片寬分別高達(dá)葉片細(xì)小莖段的4.74倍和2.24倍。除苗高外，葉片細(xì)小莖段的各指標(biāo)數(shù)值均為最小值，說明不同途徑誘導(dǎo)形成的材料對走馬胎組培苗增殖的影響較大；葉片誘導(dǎo)形成不定芽的苗高、鮮質(zhì)量和莖節(jié)長均與腋芽差異顯著，葉片細(xì)小莖段各指標(biāo)與腋芽均差異顯著，且隸屬函數(shù)法綜合評價結(jié)果為腋芽最優(yōu)，與唐鳳鸞等[9]報道的走馬胎腋芽誘導(dǎo)結(jié)果相似。

在生根培養(yǎng)中，不同途徑誘導(dǎo)形成的材料對走馬胎組培苗生根的影響較大。葉片誘導(dǎo)不定芽的根長為最大值，其余各指標(biāo)的最大值均為腋芽，且為其余兩類材料的1.3倍以上，其中生根率和葉片寬分別為葉片細(xì)小莖段材料的1.75倍和2.07倍。除苗高外，葉片細(xì)小莖段的各指標(biāo)數(shù)值均為最小值。葉片誘導(dǎo)不定芽和葉片細(xì)小莖段的生根率均較低，根數(shù)較少；葉片誘導(dǎo)不定芽的根長過長，為最大值。評判生根培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素是生根率、根數(shù)和根長，最好的生根效果是生根率較高、根數(shù)較多和根長適中[8]。隸屬函數(shù)法綜合評價的結(jié)果為腋芽最優(yōu)，其次是葉片誘導(dǎo)不定芽，最差的是葉片細(xì)小莖段。說明在走馬胎組培育苗中，3種材料中腋芽為最佳接種材料，可用于走馬胎組培苗工廠化生產(chǎn)，葉片誘導(dǎo)不定芽和葉片細(xì)小莖段不宜作為接種材料，以節(jié)省接種用時并提高接種效率和質(zhì)量。