李智明，楊 娜，朱健萍，鄧 鳴，鄭美玲

(廣西食品藥品檢驗所，廣西南寧 530021)

0 引言

非那雄胺為合成的甾體激素化合物，化學名為N-叔丁基-3-羰基-4-氮雜-5α-雄甾-1-烯-17β-酰胺，分子式為C23H36N2O2[1]。其制劑最早由美國默沙東公司于1991年開發(fā)研制，國內(nèi)首仿成功的是天方藥業(yè)公司[2]。非那雄胺是Ⅱ型5α-還原酶特異性抑制劑，在人體內(nèi)通過阻礙睪酮轉化為雙氫睪酮，抑制睪酮代謝，可抑制前列腺增生，也可減輕雄激素對脫發(fā)的影響；其制劑規(guī)格為5 mg用于治療和控制良性前列腺增生及相關癥狀，規(guī)格為1 mg用于治療雄性激素源性脫發(fā)[3-7]。非那雄胺合成工藝一般以3-羰基-4-雄甾烯-17β-羧酸為起始原料，經(jīng)過酰胺化、氧化、還原等反應得到目標產(chǎn)物非那雄胺[8]。在其合成過程中，各種反應不可避免使用重金屬元素作為催化劑、還原劑或者氧化劑等，起始原料和使用的各種容器也會引入重金屬元素。

藥品重金屬元素的存在，對人體健康具有潛在危害，這也是公眾關心的問題[9-12]。重金屬進入人體后，很難被生物降解，會不斷地積蓄，與體內(nèi)相關的酶及蛋白質發(fā)生相互作用，由量變達到質變，影響人體正常生理機能、干擾新陳代謝。基于重金屬元素的毒性劃分，第一類重金屬元素對人體有毒，包括As、Cd、Hg、Pb 4種；Se和Pd屬于第二類，在原料藥生產(chǎn)中添加時需要進行風險評估[13]。當前國內(nèi)外普遍采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)作為分析元素的工具，它能同時測定多種元素，且線性范圍廣，抗干擾能力強，靈敏度較高，分析速度快，是同時測定多種元素的首選方法[14-18]。按《中華人民共和國藥典》2015版二部的標準，非那雄胺需進行硒、砷鹽、重金屬總量檢查[1]，實驗操作采用的是化學反應比色法，定性進行比較。為了定量考察非那雄胺原料藥中有毒有害元素，同時測定其生產(chǎn)工藝中所使用的催化劑殘留量，進一步完善質量標準，保障用藥安全性，本研究建立ICP-MS法同時測定其中7種元素含量，并進行方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

NexION 350電感耦合等離子體質譜儀(美國PE公司)；MARS6微波消解儀(美國CEM公司)，配恒溫加熱板；XS205DU電子分析天平(METTLER公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、鉛(Pb)、鉻(Cr)單元素標準溶液濃度均為1 000 μg/mL，均為中國計量科學研究院產(chǎn)品，批號分別為GBW08612/17022，GBW(E)08611/15105，GBW08612/17022，GBW08619/16063，GBW08614/14113。鈀(Pd)單元素標準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號GSB04-1745-2004，唯一標識191066，濃度1 000 μg/mL)；硒(Se)單元素標準溶液(壇墨質檢-標準物質中心，批號B1904055/CW：G-158，濃度1 000 μg/mL)；Internal Standard Mix(Agilent Technologies，Part#5183-4681，Sc、Ge、In、Bi、Tb、Y、Li6，濃度10 μg/mL)；硝酸、過氧化氫為優(yōu)級純。非那雄胺原料藥樣品總共22批，分別由國內(nèi)22個制劑生產(chǎn)廠家(編號1—22號)提供，均來源于兩家原料藥生產(chǎn)廠家。

1.2 方法

1.2.1 ICP-MS條件

儀器點火穩(wěn)定后，用調諧液對儀器質量軸、氧化物、雙電荷、靈敏度和分辨率等進行優(yōu)化。根據(jù)待測元素特性，采用兩種工作模式，Se采用標準模式，其他元素采用氦氣碰撞模式。儀器參數(shù)設置：射頻功率為1 550 W，氦氣流量為4.3 mL/min，等離子體氣流量為16.0 L/min，霧化氣流量為1.0 L/min，輔助氣流量為1.0 L/min，樣品提升速率為1.0 mL/min，停留時間和積分時間均為50 ms，樣品掃描次數(shù)20次，重復次數(shù)3次。各元素分析參數(shù)見表1。

表1 各元素分析參數(shù)

1.2.2 標準溶液制備

精密量取7種元素標準溶液適量，用5%(V∶V)硝酸溶液逐級稀釋，得到As、Cd、Cr、Pb、Pd、Se濃度為0，1，2，4，8，16，20 ng/mL；Hg濃度為0.0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ng/mL，共7個濃度級別的7種元素混合標準曲線系列。

精密量取混合內(nèi)標母液2 mL置于50 mL容量瓶中，用5%(V∶V)的硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻得到Sc、Ge、In、Bi、Tb、Y、Li6濃度為400 ng/mL的混合內(nèi)標溶液。

1.2.3 樣品溶液制備

精密稱取樣品0.5 g置于微波消解罐中，加入6 mL濃硝酸，置于加熱板上90℃加熱40 min，揮發(fā)大部分氣體。取下冷卻后加入1 mL濃硝酸和1 mL過氧化氫，安裝好消解罐，按照升溫程序消解樣品：10 min升到135℃，保持5 min，1 500 W；10 min升到150℃，1 500 W；25 min升到190℃，保持30 min，1 500 W。消解完畢冷卻后打開消解罐，于加熱板上90℃趕酸氣30 min，冷卻后將消解液轉移至50 mL容量瓶中，并用超純水多次清洗消解罐與蓋子，洗液并入容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻即得。同時做樣品空白試驗。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

采用全定量分析模式，依次測定1.2.2節(jié)的標準曲線、1.2.3節(jié)樣品空白溶液和樣品溶液，同時以三通管的形式在線加入1.2.2節(jié)的混合內(nèi)標溶液，按1.2.1節(jié)ICP-MS條件進行測定，以待測定元素與內(nèi)標(以Sc為內(nèi)標測定Cr，以Ge為內(nèi)標測定As、Se，以In為內(nèi)標測定Cd、Pd，以Bi為內(nèi)標測定Hg、Pb)響應值的比值為縱坐標，各待測元素質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，由此計算待測樣品質量濃度。線性方程與線性范圍見表2。

表2 線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.2 檢出限與定量限考察

由儀器測定曲線得到儀器檢出限(DL)，即連續(xù)11次測定標準空白儀器響應值標準偏差的3倍；定量限則是連續(xù)11次測定標準空白儀器響應值標準偏差的10倍，再根據(jù)實際取樣量和稀釋倍數(shù)計算方法檢出限、定量限(表2)。

2.3 精密度試驗

取1.2.2節(jié)的配制的混合標準溶液(Hg濃度為1.6 ng/mL，其余元素濃度為16 ng/mL)適量，按1.2.1節(jié)ICP-MS條件進樣測定6次，記錄儀器響應值。結果As、Cd、Cr、Hg、Pb、Pd、Se儀器響應值的RSD分別為3.0%、2.4%、2.5%、1.2%、2.2%、3.2%、2.3%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取1.2.2節(jié)配制的混合標準溶液(Hg濃度為1.6 ng/mL，其余元素濃度為16 ng/mL)適量，于室溫下放置0，2，4，8，16，24 h時，按1.2.1節(jié)的ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應值。結果As、Cd、Cr、Hg、Pb、Pd、Se儀器響應值的RSD分別為3.3%、3.0%、2.8%、1.8%、2.4%、3.4%、2.5%

(n=6)，表明各個元素標準溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復性試驗

精密稱取1號廠家提供的樣品0.5 g，共6份，分別置于微波消解罐中，精密加入加樣回收試驗中質量濃度的混合標準溶液，按1.2.3節(jié)方法制備樣品溶液，再按1.2.1節(jié)ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應值。結果As、Cd、Cr、Hg、Pb、Pd、Se儀器響應值的RSD分別為3.9%、3.1%、2.5%、2.2%、2.6%、3.8%、2.7%(n=6)，表明樣品重復性良好。

2.6 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的樣品(1號廠家提供)0.5 g，共9份，分別置于微波消解罐中，精密加入低、中、高質量濃度的混合標準溶液，按1.2.3節(jié)方法制備回收樣品溶液，再按1.2.1節(jié)ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應值并計算加樣回收率，結果見表3。表3中樣品含量為0.5 g樣品中含有的各元素的量。As回收率偏高(超過100%)可能是因為樣品基質對儀器測定有影響(Ar40Cl35)。

表3 加樣回收率試驗結果(n=9)

續(xù)表3

2.7 樣品元素測定

取國內(nèi)22個非那雄胺制劑生產(chǎn)企業(yè)提供的非那雄胺原料藥，按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，再按1.2.1節(jié)ICP-MS條件進樣測定，平行測定3次，記錄儀器響應值并按標準曲線法計算樣品中7種元素的含量，結果見表4。

2.8 樣品元素測定結果分析

22批樣品測定結果顯示，Se均未檢出，As、Cd、Hg分別只有4，2，1批檢出，但其含量均較低，接近相應的檢出限；Pd有17批檢出，其含量為1.05—1.94 μg/kg，稍微大于其檢出限1 μg/kg；Cr有8批檢出，其含量為8.78—224.88 μg/kg；Pb有20批檢出，其含量為22.56—1 394.74 μg/kg，是所有元素中含量最高的。Pb進入人體會后很難排出，會不斷蓄積，達到一定濃度會對人體的腦部細胞有損傷，而且會干擾代謝活動，降低人體免疫力[19]，因此在合成非那雄胺原料藥時還應控制好鉛含量，盡量降低其含量。非那雄胺收載于《中華人民共和國藥典》2015年二部[1]，其檢查項目中規(guī)定，重金屬總量不得超過10 μg/g、砷鹽含量不得超過4 μg/g、硒含量不得超過50 μg/g，本研究22批樣品均在限度規(guī)定范圍內(nèi)。國際人用藥品注冊技術協(xié)調會(ICH)發(fā)布的指導原則“Q3D”規(guī)定口服藥品制劑中元素每日最大暴露量(PDE)[20]，參考該限值并按照非那雄胺片(膠囊)說明書中成人每日口服藥劑量為5 mg，使用表3中各元素含量最大值計算出每日攝入量，詳見表5。22批樣品各元素每日攝入量均遠低于PDE，表明非那雄胺原料藥中這些元素含量控制較好，總體風險較小。

表4 樣品含量測定結果(n=3，μg/kg)

表5 元素每日最大暴露量及制劑每日攝入量

3 討論

3.1 元素Se同位素與測定模式的選擇

選擇同位素時，以優(yōu)先選擇最高豐度值為原則，但是要避免同量異位素重疊和多原子干擾。Se具有6個可檢測到的穩(wěn)定同位素，分別是74Se、76Se、77Se、78Se、80Se、82Se[21]，雖然78Se與80Se豐度較高，但是在測定時會受到多原子40Ar38Ar+、38Ar40Ca+、40Ar40Ar+等形成的質譜干擾[22]，76Se也受38Ar38Ar+的干擾，而74Se是因為豐度太低不適合采用；82Se受到82Kr的干擾[23]。雖然可利用干擾方程消除影響，但是內(nèi)標校正還是比較差，所作回歸曲線不理想，故選擇77Se進行測定。碰撞模式就是將氦氣通入碰撞池內(nèi)，通過碰撞改變動能達到消除干擾物質的作用，但儀器靈敏度會降低；標準模式即單純使用氬氣進行測定。由于77Se原本豐度值就比較低，所用77Se最好使用標準模式進行測定。本研究所用儀器可以用氦氣碰撞模式與標準模式同時測定，所以除Se外的元素均用氦氣碰撞模式進行測定。

3.2 消解體系的選擇

非那雄胺為白色結晶性粉末，是一種甾體化合物，純度比較高，無其他難消解的化合物，因此首選硝酸作為消解溶劑。本課題前期考察了使用6，7，8，9，10 mL的硝酸及硝酸與1，2 mL過氧化氫對樣品的消解效果，由于樣品是粉末狀，產(chǎn)生煙氣比較多，單使用硝酸需要9 mL以上才能消解完全。本次實驗采用是小型消解罐，不能加10 mL以上的硝酸，否則會有爆罐的風險，因此考慮加過氧化氫增強氧化性，減少硝酸使用量。通過試驗選用消解體系為7 mL硝酸和1 mL過氧化氫。

3.3 生產(chǎn)工藝的改變

通過查閱文獻可知，非那雄胺以前的合成工藝中脫氫反應步驟使用的是苯亞硒酸酐[8]，因此《中華人民共和國藥典》2015年二部[1]收載的非那雄胺需要進行硒檢查。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，響應保護環(huán)境的號召，毒性較大的苯亞硒酸酐被DDQ/BSTFA等試劑代替；而加氫步驟則使用鈀碳作為催化劑，這與表4中的Se均未檢出、Pd大部分有檢出的檢測結果相符。由表4中可知，Pd含量比較小，表明在合成工藝中鈀碳催化劑的使用控制得比較好，沒有在非那雄胺中較多地殘留。在調研時非那雄胺生產(chǎn)企業(yè)也反饋了此信息，希望檢驗標準中能刪除硒檢查項，增加鈀檢查項。為了能較好地監(jiān)控非那雄胺原料藥的質量，完善質量標準，希望制定藥品質量標準的相關部門能盡快著手，保障用藥安全性。

4 結論

綜上，采用ICP-MS測定非那雄胺中7種元素含量，方法簡便、快速，精密度及穩(wěn)定性好，靈敏度高，為其質量控制及完善質量標準提供了實驗基礎。