唐健民，漆小雪，蔣運(yùn)生，熊忠臣，鄒 蓉

(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006)

0 引言

黑老虎(Kadsuracoccinea)是五味子科南五味子屬藤本植物，別名冷飯團(tuán)、過山龍?zhí)伲诮?、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地。黑老虎莖、葉一年四季青綠，可用于綠廊、涼亭等園林配置[1]。其果型為聚合果，果大有光澤，表面紋理像菠蘿，垂吊如燈籠，具有較高的觀賞價(jià)值。黑老虎根可入藥，活血行氣，消腫止痛，治療胃病，亦常用于婦科[2]。目前，市場上對黑老虎的關(guān)注度越來越高，而野生資源的過度采挖，致使黑老虎種群生存情況不容樂觀[3]。國內(nèi)外關(guān)于黑老虎化學(xué)成分、藥理作用、揮發(fā)油成分、栽培技術(shù)的研究較多[4-13]，但有關(guān)其遺傳多樣性的研究并不多見。為準(zhǔn)確揭示黑老虎遺傳多樣性，急需建立其特定的多樣性檢測體系。ISSR是一種建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記，具有操作方便、低成本、遺傳多態(tài)性高等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析等研究領(lǐng)域[14-18]。每一個(gè)物種的ISSR-PCR反應(yīng)體系最適宜的條件不同，黑老虎的最適宜條件需進(jìn)一步摸索。本文運(yùn)用正交設(shè)計(jì)及單因素試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量、擴(kuò)增程序中退火溫度及循環(huán)次數(shù)等黑老虎ISSR-PCR反應(yīng)體系的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期建立并優(yōu)化黑老虎的ISSR-PCR反應(yīng)體系，為其遺傳多樣性評價(jià)等深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料于2018年9月采自廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所種質(zhì)資源圃，采集生長良好、色澤亮麗、健康無蟲害的新鮮葉片2—3片，保存于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后用液氮冷凍。樣品經(jīng)廣西植物研究所漆小雪研究員鑒定為黑老虎(Kadsuracoccinea)葉片。

1.2 儀器及藥品

藥品試劑：ISSR引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker S、瓊脂糖，以上試劑都購于卓一生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀(美國BIO-RAD伯樂公司),DYCP-34型電泳槽(北京市六一儀器廠),TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司),UVP凝膠成像系統(tǒng),CDYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠),-20℃冰箱,-4℃冰箱。

1.3 方法

1.3.1 黑老虎植物基因組DNA的提取

采用CTAB法對黑老虎植物基因組DNA進(jìn)行提取。用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)所提取基因組DNA的質(zhì)量和完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測基因組DNA的純度和濃度。

1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)

不同的物種有各自最佳的ISSR反應(yīng)體系，要建立一個(gè)適于黑老虎的ISSR反應(yīng)體系需要先對該體系進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用正交方案進(jìn)行初步的篩選，隨后利用單因素設(shè)計(jì)針對性地統(tǒng)一優(yōu)化，優(yōu)化的內(nèi)容包括Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量、PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)、退火溫度等。

采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定每個(gè)因素中擴(kuò)增效果最好的條件。正交試驗(yàn)主要包括設(shè)計(jì)Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶、DNA、dNTPs這5個(gè)試驗(yàn)因素的梯度差。每一個(gè)因素都設(shè)計(jì)4個(gè)濃度梯度差，如表1、表2所示。為避免偶然性發(fā)生，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。除此之外，這4個(gè)濃度梯度系列中，每個(gè)體系都加入2.5 μL 10× PCR Buffer，最后用滅菌后的ddH2O補(bǔ)足至20 μL。本次選用的引物為866(序列為5′-CTC CTC CTC CTC CTC CTC-3′)。退火溫度為54℃。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 ISSR-PCR 正交試驗(yàn)L16(45)

PCR擴(kuò)增程序：在94℃條件下預(yù)變性5 min，94℃條件下變性30 s，54℃條件下退火50 s，72℃條件下延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)展結(jié)束后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳1.0—1.5 h，用溴化乙啶染色20—25 min，隨后采用UVP凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照備注保存。

1.3.3 ISSR-PCR反應(yīng)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每個(gè)因素設(shè)計(jì)的水平如下：Mg2+濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L；dNTPs濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L；引物濃度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L；Taq DNA聚合酶用量為0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 U；DNA模板用量為15，30，45，60，75，90 ng。

1.3.4 ISSR-PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化

根據(jù)正交試驗(yàn)及單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步確定反應(yīng)體系后，繼續(xù)對退火溫度以及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度設(shè)置為(Tm±5)℃，如(51±5)℃，那么PCR儀自動(dòng)形成12個(gè)溫度梯度：46.0，46.3，47.0，48.0，49.2，50.4，51.6，52.8，54.0，55.0，55.7，56.0℃。循環(huán)次數(shù)設(shè)置為25，30，35，40，45，50次。以上處理重復(fù)2次，避免偶然性存在。

1.3.5 ISSR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

可是，匆忙而零碎的時(shí)光似乎打亂了我固有的步調(diào)，我常懶慵地伸長了脖子，聽著窗外車輛的催鳴。干燥的都市里人如蟻般的潮涌，較童年時(shí)期的鄉(xiāng)村生活，這一切來得如此突兀而遙遠(yuǎn)，又在一刻間抹去，夢走過它的輝煌漸次露出衰敗的荒漠。遙遙的還有什么景物，高樓把零星的綠踩在腳底，慌亂地走進(jìn)我的視線，模糊成一堆垃圾似的骯臟。我的思緒走在傷感與悵然的懸崖邊沿，細(xì)數(shù)著空中飛過的鳥影，在白云下面彈出點(diǎn)點(diǎn)，我渴望那白云就是心中的空白，這正是我空靈和寂寞的源點(diǎn)。

從黑老虎提取的DNA中隨機(jī)選取2個(gè)樣品，用前期試驗(yàn)確定的反應(yīng)體系對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，以此檢驗(yàn)擴(kuò)增效果的穩(wěn)定性。利用正交試驗(yàn)以及單因素試驗(yàn)確定的ISSR-PCR反應(yīng)體系對引物進(jìn)行篩選，從黑老虎的DNA樣品中隨機(jī)選擇出2個(gè)樣品作為ISSR-PCR反應(yīng)體系的模板，對100條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從擴(kuò)增效果好的條帶中，選擇出條帶明亮、清晰、重復(fù)性好的引物進(jìn)行ISSR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)結(jié)果

由ISSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可知，組合3，14，15部分重復(fù)沒有條帶出現(xiàn)，這些組合擴(kuò)增效果最差。組合1，2，4，7，8，9，12，16有條帶，但是條帶不明顯，模糊不清，很難辨別。組合5，6，10，11，13具有清晰明亮的條帶，組合5的條帶最具有層次性，清晰可辨，且3次重復(fù)具有正態(tài)性，因此選擇該組合作為單因素試驗(yàn)點(diǎn)樣的基礎(chǔ)。

2.2 Mg2+濃度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

由圖2可以看出，Mg2+濃度低時(shí)ISSR-PCR擴(kuò)增效果較差，條帶模糊不清晰或缺失。隨著Mg2+濃度的加大，條帶越來越清晰；當(dāng)濃度為2.5 mmol/L時(shí)，條帶較為清晰，亮度最高。因此，選擇Mg2+濃度為2.5 mmol/L作為下一步研究的條件。

2.3 dNTPs濃度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

dNTPs對ISSR-PCR的影響如圖3所示。在20 μL體系中，dNTPs濃度為0.10 mmol/L時(shí)，條帶最清晰；提高dNTPs濃度，擴(kuò)增條帶清晰度呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選擇dNTPs濃度為0.10 mmol/L作為下一步試驗(yàn)的條件。

1—16分別對應(yīng)正交試驗(yàn)組合1—16

1—6對應(yīng)的Mg2+濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L

1—6表示dNTPs濃度分別為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mmol/L

2.4 引物濃度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

不同的引物濃度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響如圖4所示，引物濃度為0.6 μmol/L時(shí)最適合ISSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增。其余條帶的情況則表明，在20 μL體系時(shí)，其他的引物濃度不利于黑老虎的PCR擴(kuò)增。故選擇引物濃度為0.6 μmol/L進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.5 Taq DNA聚合酶用量對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Taq DNA聚合酶的用量會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物，用量多則成本高，且容易擴(kuò)增出非特異性產(chǎn)物，但用量少又會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成的效率低[16]。如圖5所示，在20 μL體系里，Taq DNA聚合酶用量為0.25—1.00 U時(shí)，幾乎沒有產(chǎn)物出現(xiàn)；Taq DNA聚合酶用量為1.50 U時(shí)(編號(hào)4)，條帶清晰、亮度高，故選擇1.50 U作為下一步試驗(yàn)的Taq DNA聚合酶用量。

2.6 模板DNA用量對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

如圖6所示，編號(hào)1，2，5，6產(chǎn)物所擴(kuò)增的條帶不夠清晰明亮，背景模糊不清，表明生成的產(chǎn)物較少，因此模板 DNA用量為15，30，75，90 ng 時(shí)，ISSR-PCR擴(kuò)增效果差。編號(hào)3的產(chǎn)物條帶明亮清晰，故選擇45 ng模板DNA用量進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

1—6表示引物濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L

1—6表示Taq DNA酶用量分別為0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 U

2.7 退火溫度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

退火溫度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響如圖7所示，部分組合沒有條帶產(chǎn)生，表明該退火溫度不適合黑老虎ISSR-PCR的擴(kuò)增。退火溫度在50.4℃時(shí)，條帶的強(qiáng)度高，清晰明亮，副帶也清晰，因此該引物的最佳退火溫度確定為50.4℃，其他引物的退火溫度也采用同樣的退火溫度梯度進(jìn)行篩選。

1—6表示模板DNA用量分別為15，30，45，60，75，90 ng

1—12代表退火溫度分別為 46.0，46.3，47.0，48.0， 49.2，50.4，51.6，52.8，54.0，55.0，55.7，56.0℃

2.8 循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響如圖8所示，一共有6個(gè)循環(huán)組合，每個(gè)循環(huán)組合設(shè)立了6次重復(fù)試驗(yàn)。循環(huán)次數(shù)為25，30次時(shí)沒有條帶出現(xiàn)，表明該循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增效果不佳。循環(huán)次數(shù)為35，45，50次時(shí)有些許的條帶出現(xiàn)，但條帶模糊不清晰，強(qiáng)度弱，層次不分明，擴(kuò)增產(chǎn)物較少，故不選擇。循環(huán)次數(shù)為40次時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物較多，條帶清晰，層次分明，強(qiáng)度高，條帶的數(shù)目也明顯更多。故而40次為最佳循環(huán)次數(shù)。

1—6表示循環(huán)次數(shù)為20，25，30，35，40，45次

3 討論

單獨(dú)采用單因素試驗(yàn)僅考慮單個(gè)因素不同水平對試驗(yàn)結(jié)果的影響，忽視了各個(gè)因素之間的相互作用，在優(yōu)化試驗(yàn)組合時(shí)，會(huì)一定程度上降低最佳反應(yīng)水平的可靠程度[19-20]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮多個(gè)因素水平的相互作用，利用最少的組合數(shù)考察因素和水平對結(jié)果的影響程度，得出最佳組合。本試驗(yàn)先用正交試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，再通過單因素試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，極大地減少了試驗(yàn)次數(shù)和時(shí)間，快速建立黑老虎的ISSR-PCR反應(yīng)體系。試驗(yàn)結(jié)果顯示，黑老虎ISSR-PCR反應(yīng)體系對Mg2+濃度要求嚴(yán)格，濃度過低時(shí)無法擴(kuò)增出條帶。這可能是由于反應(yīng)體系中其他因素對Mg2+較為敏感，如Mg2+是Taq DNA聚合酶的必需激活劑，體系中Mg2+濃度過高，會(huì)出現(xiàn)Taq DNA聚合酶擴(kuò)增出的特異性產(chǎn)物濃度降低，濃度過低會(huì)降低酶的效率。Mg2+可與其他因素結(jié)合，最終影響PCR擴(kuò)增的效率和特異性。由以上的正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，在20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中，黑老虎的最佳反應(yīng)條件為Mg2+濃度為2.5 mmol/L、dNTPs濃度為0.1 mmol/L、引物濃度為0.6 μmol/L、Taq DNA聚合酶用量為1.50 U、模板DNA用量為45 ng。擴(kuò)增程序?yàn)樵?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50.4℃退火30 s，72℃延伸30 s，以上3個(gè)步驟循環(huán)40次；最后72℃延伸10 min。本試驗(yàn)首次研究建立黑老虎ISSR-PCR反應(yīng)體系，并獲得穩(wěn)定可靠結(jié)果，可以適應(yīng)于其他黑老虎品種，為今后黑老虎遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)。