唐健民,漆小雪,蔣運(yùn)生,熊忠臣,鄒 蓉
(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西桂林 541006)
黑老虎(Kadsuracoccinea)是五味子科南五味子屬藤本植物,別名冷飯團(tuán)、過山龍?zhí)伲诮?、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地。黑老虎莖、葉一年四季青綠,可用于綠廊、涼亭等園林配置[1]。其果型為聚合果,果大有光澤,表面紋理像菠蘿,垂吊如燈籠,具有較高的觀賞價(jià)值。黑老虎根可入藥,活血行氣,消腫止痛,治療胃病,亦常用于婦科[2]。目前,市場上對黑老虎的關(guān)注度越來越高,而野生資源的過度采挖,致使黑老虎種群生存情況不容樂觀[3]。國內(nèi)外關(guān)于黑老虎化學(xué)成分、藥理作用、揮發(fā)油成分、栽培技術(shù)的研究較多[4-13],但有關(guān)其遺傳多樣性的研究并不多見。為準(zhǔn)確揭示黑老虎遺傳多樣性,急需建立其特定的多樣性檢測體系。ISSR是一種建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記,具有操作方便、低成本、遺傳多態(tài)性高等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析等研究領(lǐng)域[14-18]。每一個(gè)物種的ISSR-PCR反應(yīng)體系最適宜的條件不同,黑老虎的最適宜條件需進(jìn)一步摸索。本文運(yùn)用正交設(shè)計(jì)及單因素試驗(yàn)相結(jié)合的方法,對Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量、擴(kuò)增程序中退火溫度及循環(huán)次數(shù)等黑老虎ISSR-PCR反應(yīng)體系的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究,以期建立并優(yōu)化黑老虎的ISSR-PCR反應(yīng)體系,為其遺傳多樣性評價(jià)等深入研究奠定基礎(chǔ)。
試驗(yàn)材料于2018年9月采自廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所種質(zhì)資源圃,采集生長良好、色澤亮麗、健康無蟲害的新鮮葉片2—3片,保存于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后用液氮冷凍。樣品經(jīng)廣西植物研究所漆小雪研究員鑒定為黑老虎(Kadsuracoccinea)葉片。
藥品試劑:ISSR引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker S、瓊脂糖,以上試劑都購于卓一生物技術(shù)有限公司。
實(shí)驗(yàn)儀器:PCR儀(美國BIO-RAD伯樂公司),DYCP-34型電泳槽(北京市六一儀器廠),TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司),UVP凝膠成像系統(tǒng),CDYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠),-20℃冰箱,-4℃冰箱。
1.3.1 黑老虎植物基因組DNA的提取
采用CTAB法對黑老虎植物基因組DNA進(jìn)行提取。用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)所提取基因組DNA的質(zhì)量和完整性,用紫外分光光度計(jì)檢測基因組DNA的純度和濃度。
1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)
不同的物種有各自最佳的ISSR反應(yīng)體系,要建立一個(gè)適于黑老虎的ISSR反應(yīng)體系需要先對該體系進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用正交方案進(jìn)行初步的篩選,隨后利用單因素設(shè)計(jì)針對性地統(tǒng)一優(yōu)化,優(yōu)化的內(nèi)容包括Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量、PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)、退火溫度等。
采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定每個(gè)因素中擴(kuò)增效果最好的條件。正交試驗(yàn)主要包括設(shè)計(jì)Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶、DNA、dNTPs這5個(gè)試驗(yàn)因素的梯度差。每一個(gè)因素都設(shè)計(jì)4個(gè)濃度梯度差,如表1、表2所示。為避免偶然性發(fā)生,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。除此之外,這4個(gè)濃度梯度系列中,每個(gè)體系都加入2.5 μL 10× PCR Buffer,最后用滅菌后的ddH2O補(bǔ)足至20 μL。本次選用的引物為866(序列為5′-CTC CTC CTC CTC CTC CTC-3′)。退火溫度為54℃。
表1 正交試驗(yàn)因素水平
表2 ISSR-PCR 正交試驗(yàn)L16(45)
PCR擴(kuò)增程序:在94℃條件下預(yù)變性5 min,94℃條件下變性30 s,54℃條件下退火50 s,72℃條件下延伸5 min,4℃保存。擴(kuò)展結(jié)束后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳1.0—1.5 h,用溴化乙啶染色20—25 min,隨后采用UVP凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照備注保存。
1.3.3 ISSR-PCR反應(yīng)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每個(gè)因素設(shè)計(jì)的水平如下:Mg2+濃度為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mmol/L;dNTPs濃度為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mmol/L;引物濃度為0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 μmol/L;Taq DNA聚合酶用量為0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50 U;DNA模板用量為15,30,45,60,75,90 ng。
1.3.4 ISSR-PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化
根據(jù)正交試驗(yàn)及單因素試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步確定反應(yīng)體系后,繼續(xù)對退火溫度以及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度設(shè)置為(Tm±5)℃,如(51±5)℃,那么PCR儀自動(dòng)形成12個(gè)溫度梯度:46.0,46.3,47.0,48.0,49.2,50.4,51.6,52.8,54.0,55.0,55.7,56.0℃。循環(huán)次數(shù)設(shè)置為25,30,35,40,45,50次。以上處理重復(fù)2次,避免偶然性存在。
1.3.5 ISSR反應(yīng)體系的驗(yàn)證
可是,匆忙而零碎的時(shí)光似乎打亂了我固有的步調(diào),我常懶慵地伸長了脖子,聽著窗外車輛的催鳴。干燥的都市里人如蟻般的潮涌,較童年時(shí)期的鄉(xiāng)村生活,這一切來得如此突兀而遙遠(yuǎn),又在一刻間抹去,夢走過它的輝煌漸次露出衰敗的荒漠。遙遙的還有什么景物,高樓把零星的綠踩在腳底,慌亂地走進(jìn)我的視線,模糊成一堆垃圾似的骯臟。我的思緒走在傷感與悵然的懸崖邊沿,細(xì)數(shù)著空中飛過的鳥影,在白云下面彈出點(diǎn)點(diǎn),我渴望那白云就是心中的空白,這正是我空靈和寂寞的源點(diǎn)。
從黑老虎提取的DNA中隨機(jī)選取2個(gè)樣品,用前期試驗(yàn)確定的反應(yīng)體系對樣品進(jìn)行擴(kuò)增,以此檢驗(yàn)擴(kuò)增效果的穩(wěn)定性。利用正交試驗(yàn)以及單因素試驗(yàn)確定的ISSR-PCR反應(yīng)體系對引物進(jìn)行篩選,從黑老虎的DNA樣品中隨機(jī)選擇出2個(gè)樣品作為ISSR-PCR反應(yīng)體系的模板,對100條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從擴(kuò)增效果好的條帶中,選擇出條帶明亮、清晰、重復(fù)性好的引物進(jìn)行ISSR分析。
由ISSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可知,組合3,14,15部分重復(fù)沒有條帶出現(xiàn),這些組合擴(kuò)增效果最差。組合1,2,4,7,8,9,12,16有條帶,但是條帶不明顯,模糊不清,很難辨別。組合5,6,10,11,13具有清晰明亮的條帶,組合5的條帶最具有層次性,清晰可辨,且3次重復(fù)具有正態(tài)性,因此選擇該組合作為單因素試驗(yàn)點(diǎn)樣的基礎(chǔ)。
由圖2可以看出,Mg2+濃度低時(shí)ISSR-PCR擴(kuò)增效果較差,條帶模糊不清晰或缺失。隨著Mg2+濃度的加大,條帶越來越清晰;當(dāng)濃度為2.5 mmol/L時(shí),條帶較為清晰,亮度最高。因此,選擇Mg2+濃度為2.5 mmol/L作為下一步研究的條件。
dNTPs對ISSR-PCR的影響如圖3所示。在20 μL體系中,dNTPs濃度為0.10 mmol/L時(shí),條帶最清晰;提高dNTPs濃度,擴(kuò)增條帶清晰度呈現(xiàn)下降趨勢。因此,選擇dNTPs濃度為0.10 mmol/L作為下一步試驗(yàn)的條件。
1—16分別對應(yīng)正交試驗(yàn)組合1—16
1—6對應(yīng)的Mg2+濃度分別為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mmol/L
1—6表示dNTPs濃度分別為0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60 mmol/L
不同的引物濃度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響如圖4所示,引物濃度為0.6 μmol/L時(shí)最適合ISSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增。其余條帶的情況則表明,在20 μL體系時(shí),其他的引物濃度不利于黑老虎的PCR擴(kuò)增。故選擇引物濃度為0.6 μmol/L進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
Taq DNA聚合酶的用量會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物,用量多則成本高,且容易擴(kuò)增出非特異性產(chǎn)物,但用量少又會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成的效率低[16]。如圖5所示,在20 μL體系里,Taq DNA聚合酶用量為0.25—1.00 U時(shí),幾乎沒有產(chǎn)物出現(xiàn);Taq DNA聚合酶用量為1.50 U時(shí)(編號(hào)4),條帶清晰、亮度高,故選擇1.50 U作為下一步試驗(yàn)的Taq DNA聚合酶用量。
如圖6所示,編號(hào)1,2,5,6產(chǎn)物所擴(kuò)增的條帶不夠清晰明亮,背景模糊不清,表明生成的產(chǎn)物較少,因此模板 DNA用量為15,30,75,90 ng 時(shí),ISSR-PCR擴(kuò)增效果差。編號(hào)3的產(chǎn)物條帶明亮清晰,故選擇45 ng模板DNA用量進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。
1—6表示引物濃度分別為0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 μmol/L
1—6表示Taq DNA酶用量分別為0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50 U
退火溫度對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響如圖7所示,部分組合沒有條帶產(chǎn)生,表明該退火溫度不適合黑老虎ISSR-PCR的擴(kuò)增。退火溫度在50.4℃時(shí),條帶的強(qiáng)度高,清晰明亮,副帶也清晰,因此該引物的最佳退火溫度確定為50.4℃,其他引物的退火溫度也采用同樣的退火溫度梯度進(jìn)行篩選。
1—6表示模板DNA用量分別為15,30,45,60,75,90 ng
1—12代表退火溫度分別為 46.0,46.3,47.0,48.0, 49.2,50.4,51.6,52.8,54.0,55.0,55.7,56.0℃
循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響如圖8所示,一共有6個(gè)循環(huán)組合,每個(gè)循環(huán)組合設(shè)立了6次重復(fù)試驗(yàn)。循環(huán)次數(shù)為25,30次時(shí)沒有條帶出現(xiàn),表明該循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增效果不佳。循環(huán)次數(shù)為35,45,50次時(shí)有些許的條帶出現(xiàn),但條帶模糊不清晰,強(qiáng)度弱,層次不分明,擴(kuò)增產(chǎn)物較少,故不選擇。循環(huán)次數(shù)為40次時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物較多,條帶清晰,層次分明,強(qiáng)度高,條帶的數(shù)目也明顯更多。故而40次為最佳循環(huán)次數(shù)。
1—6表示循環(huán)次數(shù)為20,25,30,35,40,45次
單獨(dú)采用單因素試驗(yàn)僅考慮單個(gè)因素不同水平對試驗(yàn)結(jié)果的影響,忽視了各個(gè)因素之間的相互作用,在優(yōu)化試驗(yàn)組合時(shí),會(huì)一定程度上降低最佳反應(yīng)水平的可靠程度[19-20]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮多個(gè)因素水平的相互作用,利用最少的組合數(shù)考察因素和水平對結(jié)果的影響程度,得出最佳組合。本試驗(yàn)先用正交試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選,再通過單因素試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,極大地減少了試驗(yàn)次數(shù)和時(shí)間,快速建立黑老虎的ISSR-PCR反應(yīng)體系。試驗(yàn)結(jié)果顯示,黑老虎ISSR-PCR反應(yīng)體系對Mg2+濃度要求嚴(yán)格,濃度過低時(shí)無法擴(kuò)增出條帶。這可能是由于反應(yīng)體系中其他因素對Mg2+較為敏感,如Mg2+是Taq DNA聚合酶的必需激活劑,體系中Mg2+濃度過高,會(huì)出現(xiàn)Taq DNA聚合酶擴(kuò)增出的特異性產(chǎn)物濃度降低,濃度過低會(huì)降低酶的效率。Mg2+可與其他因素結(jié)合,最終影響PCR擴(kuò)增的效率和特異性。由以上的正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果可知,在20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中,黑老虎的最佳反應(yīng)條件為Mg2+濃度為2.5 mmol/L、dNTPs濃度為0.1 mmol/L、引物濃度為0.6 μmol/L、Taq DNA聚合酶用量為1.50 U、模板DNA用量為45 ng。擴(kuò)增程序?yàn)樵?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,50.4℃退火30 s,72℃延伸30 s,以上3個(gè)步驟循環(huán)40次;最后72℃延伸10 min。本試驗(yàn)首次研究建立黑老虎ISSR-PCR反應(yīng)體系,并獲得穩(wěn)定可靠結(jié)果,可以適應(yīng)于其他黑老虎品種,為今后黑老虎遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)。