許澤輝 謝文妍 崖嬌練 蔡鵬飛 羅世強(qiáng) 徐玉嬋 蔡 稔 嚴(yán)提珍 唐 寧

1 廣西柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科 545001； 2 柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(Non-invasive Prenatal Testing，NIPT)技術(shù)是一項(xiàng)先進(jìn)的產(chǎn)前篩查技術(shù)，僅需采集孕婦靜脈血即可完成胎兒唐氏綜合征(T21)、愛(ài)德華綜合征(T18)和帕陶氏綜合征(T13)三大染色體疾病的檢測(cè)。早在1997年，香港大學(xué)盧煜明教授首次報(bào)道[1]了胎兒細(xì)胞可以通過(guò)胎盤滲透到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，胎兒游離DNA從而殘留在母體血漿中。利用高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)對(duì)母體外周血漿中的游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息技術(shù)分析，可以從中得到胎兒的遺傳信息，從而檢測(cè)胎兒是否患有染色體病。

2016年11月，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委在總結(jié)NIPT臨床試點(diǎn)工作經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)際科研成果，制定了我國(guó)《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》，指導(dǎo)全國(guó)規(guī)范有序地開(kāi)展NIPT。越來(lái)越多的醫(yī)院選擇與第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)合作的方式[2]，在保證NIPT實(shí)驗(yàn)室具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)和母嬰保健技術(shù)服務(wù)執(zhí)業(yè)許可證的前提條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[3]。整個(gè)NIPT實(shí)驗(yàn)流程都可以在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立完成，并出具檢測(cè)報(bào)告。孕婦外周血胎兒游離DNA的提取質(zhì)量是極其重要的，但是針對(duì)NIPT實(shí)驗(yàn)流程的具體步驟鮮少有人探討。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)比較由同一實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行DNA提取和DNA文庫(kù)構(gòu)建兩個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟獲得的樣本濃度與分別由不同實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立操作獲得的數(shù)據(jù)，利用qPCR進(jìn)行濃度關(guān)聯(lián)性對(duì)比，研究NIPT中孕婦外周血胎兒游離DNA提取的濃度與DNA文庫(kù)構(gòu)建定量后濃度的關(guān)系，探討在NIPT實(shí)驗(yàn)操作步驟中提高DNA提取質(zhì)量、文庫(kù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)化率等方面的質(zhì)量控制經(jīng)驗(yàn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 觀察對(duì)象 收集2018年1—12月經(jīng)知情同意的正常產(chǎn)檢的孕婦外周血標(biāo)本7 125份，送達(dá)的外周血樣本均按照外周血運(yùn)送規(guī)則進(jìn)行采集、存放和運(yùn)輸。能夠進(jìn)行孕婦外周血胎兒游離DNA提取與DNA文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的樣本必須滿足外周血血漿分離后沒(méi)有出現(xiàn)凝血、嚴(yán)重溶血，送達(dá)的外周血樣本時(shí)間距采血時(shí)間不超過(guò)72h的原則，才能繼續(xù)實(shí)驗(yàn)[4]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孕婦外周血胎兒游離DNA提?。喝龃嬖?20℃冰箱已經(jīng)分離好的外周血血漿1支，離心力17 900g離心5min，待提取DNA。按提取個(gè)數(shù)準(zhǔn)備對(duì)應(yīng)的BD管數(shù)量后，在BD管中加入磁珠、裂解液等相關(guān)提取試劑后，將離心好的血漿上清液加入到BD管中，然后使用垂直混勻儀混勻，接著用磁力架沉淀BD管中的磁珠。生物磁珠是具有細(xì)小粒徑的超順磁微球，其具有豐富的表面活性基團(tuán)，可以與各類生化物質(zhì)偶聯(lián)，并在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)分離。用于DNA分離提取的磁珠為硅基磁珠，利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場(chǎng)的作用下，DNA分子可被特異高效地吸附[5]。因此，血漿胎兒游離DNA已吸附于經(jīng)垂直混勻的磁珠里。將沉淀好的磁珠轉(zhuǎn)移至放在磁力架上的中轉(zhuǎn)管中，吸走上清液，隨后加入清洗液清洗磁珠，隨后吸走殘液加入洗脫液進(jìn)行水浴，溶液轉(zhuǎn)移到新EP管中，即完成DNA的提取[6]。使用Qubit 2.0測(cè)定DNA提取濃度，符合DNA提取濃度范圍的樣本放入-20℃凍存，等待進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)。不合格的樣本放入不合格樣本儲(chǔ)存盒中，并記錄在電子表格中。

1.2.2 DNA文庫(kù)構(gòu)建：整個(gè)建庫(kù)流程分為反應(yīng)一，反應(yīng)二和純化三個(gè)步驟。首先取出DNA樣本解凍，瞬時(shí)離心收集。反應(yīng)一和反應(yīng)二均在冰上操作。按一定比例加入緩沖液和酶，配制混合溶液mix1，混勻后分裝到0.2ml的PCR管中，并加入提取的外周血游離DNA，混勻離心后放置于設(shè)定程序的PCR儀中反應(yīng)。反應(yīng)二同樣需要按一定比例加入緩沖液和酶配制mix2，混勻后分裝到0.2ml PCR管中，再加入Adaptor T后離心撥彈混勻，放置于設(shè)定程序的PCR儀中反應(yīng)。準(zhǔn)備好兩套中轉(zhuǎn)管，用于分裝平衡好的磁珠和最終收集文庫(kù)。反應(yīng)二結(jié)束后，將樣本從0.2ml PCR管中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入分裝了磁珠的EP管中。輕柔混勻后靜置幾分鐘，后瞬時(shí)離心置于磁力架上吸附磁珠。吸棄上清，用清洗液清洗磁珠表面，后瞬離吸取殘液，在室溫晾干，加入洗脫液重懸。混勻后瞬時(shí)離心收集，置于磁力架上吸附磁珠。吸取洗脫的文庫(kù)到最終管中，即完成文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)，文庫(kù)放置于-20℃凍存[7]。構(gòu)建完后進(jìn)行qPCR定量實(shí)驗(yàn)對(duì)文庫(kù)的濃度進(jìn)行測(cè)定，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參照“qPCR定量(Real-time Quantitative PCR Detecting System)”。

1.2.3 qPCR定量：從-20℃冰箱取出上述文庫(kù)樣本，以及標(biāo)準(zhǔn)品、Mix、濃度標(biāo)準(zhǔn)品等試劑解凍。將18μl的稀釋液分裝到0.6ml EP管中。每個(gè)樣本取2μl加入，離心后渦旋混勻。另將198μl的稀釋液分裝到0.6ml EP管中，加入2μl 濃度標(biāo)準(zhǔn)品，再將稀釋了一次的濃度標(biāo)準(zhǔn)品樣本取2μl加入新的已加入198μl稀釋液的管中，離心后渦旋混勻。一版qPCR需要標(biāo)準(zhǔn)曲線standards做5個(gè)點(diǎn)，濃度標(biāo)準(zhǔn)品做雙重復(fù)和一個(gè)陰性對(duì)照(NTC，稀釋液)。依據(jù)說(shuō)明書(shū)按一定比例配制反應(yīng)液Mix，分裝到qPCR版中。將稀釋好的樣本、濃度標(biāo)準(zhǔn)品、NTC及標(biāo)準(zhǔn)品加入孔板中，檢查無(wú)誤后封膜離心。根據(jù)qPCR結(jié)果判斷文庫(kù)構(gòu)建的質(zhì)量并換算出文庫(kù)濃度。

2 結(jié)果

2.1 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度、建庫(kù)濃度與實(shí)驗(yàn)操作者之間的關(guān)聯(lián)性 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度與實(shí)驗(yàn)操作者在總體上無(wú)直接關(guān)聯(lián)性，實(shí)驗(yàn)員的提取DNA平均濃度均在0.1ng/μl以上，不屬于偏低范圍0.05～0.1ng/μl。操作步驟均按照SOP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，保證DNA的質(zhì)量。在使用磁珠法構(gòu)建文庫(kù)滿足文庫(kù)構(gòu)建濃度最低要求的情況下，通過(guò)qPCR結(jié)果查看峰型情況，文庫(kù)峰型較為尖銳且Tm值<81，可粗略判斷出構(gòu)建所需目的片段，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1不同提取人員DNA提取平均濃度

2.2 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度與建庫(kù)濃度的關(guān)聯(lián)性 經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)員對(duì)大量樣本提取、建庫(kù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，通過(guò)qubit，qPCR測(cè)定出的濃度結(jié)果，孕婦外周血胎兒游離DNA提取的濃度與文庫(kù)構(gòu)建后的濃度在總體上呈正相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)圖3。

2.3 不同操作者提取的孕婦外周血胎兒游離DNA濃度差比較 在同一時(shí)間分離血漿并凍存的標(biāo)本，經(jīng)不同操作者提取孕婦外周血胎兒游離DNA測(cè)定出的濃度無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖4。

圖2 不同建庫(kù)人員與建庫(kù)平均濃度

圖3 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度qPCR后文庫(kù)濃度比較

圖4不同操作人員兩次提取的DNA濃度差對(duì)比

3 討論

3.1 提高DNA提取的轉(zhuǎn)化率 在DNA提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)垂直混合儀混勻一段時(shí)間后，孕婦外周血胎兒游離DNA已經(jīng)吸附于磁珠中，此時(shí)如何減少磁珠的損耗是提高DNA濃度在人為操作方面的可控手法。可以從以下兩方面著手：一方面是在沉磁珠的時(shí)候，將磁珠沉淀到管子底部，做到肉眼可見(jiàn)BD管側(cè)壁清澈，無(wú)大量磁珠散布，接著將磁珠從BD管完全轉(zhuǎn)移至磁力架中管上的時(shí)候，轉(zhuǎn)移完全，涮洗幾次槍頭后再將槍頭打入BD管中；另一方面是在清洗過(guò)程中，清洗后使用真空泵吸棄上清液的時(shí)候，切勿觸碰磁珠，保持離心管在磁力架上，即可減少磁珠的損耗。

3.2 提高文庫(kù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)化率 在文庫(kù)構(gòu)建的過(guò)程中，同樣需要在遵守SOP的情況下盡可能地減少產(chǎn)物的損耗。在將DNA加入0.2ml PCR管時(shí)，注意全部加入，混勻時(shí)蓋好管蓋，輕彈混勻，防止漏液，造成污染和損耗；在上反應(yīng)二前加入混合溶液mix2的時(shí)候，注意慢吸慢打，做到加入量準(zhǔn)確；將反應(yīng)二產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至分裝好磁珠的EP管中時(shí)，注意轉(zhuǎn)移完全；在進(jìn)行純化過(guò)程中，輕柔搖動(dòng)磁力架清洗磁珠，并在吸棄上清時(shí)注意不要帶走磁珠；晾干的時(shí)候注意不要晾干過(guò)度，避免后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟中加入洗脫液混勻時(shí)磁珠結(jié)塊，混勻不均，影響文庫(kù)質(zhì)量。

3.3 通過(guò)qPCR圖像反映文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量 目前評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量和數(shù)量的主要參數(shù)為文庫(kù)片段大小及濃度[5]，通過(guò)qPCR結(jié)果的峰型和位置可以判斷文庫(kù)的質(zhì)量是否合格，如出現(xiàn)峰寬、雙峰、峰的Tm值>81(dimer峰)，都影響著文庫(kù)質(zhì)量。除此之外，文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率和復(fù)雜度也會(huì)對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。在建庫(kù)反應(yīng)一二過(guò)程中操作不夠迅速，導(dǎo)致酶反應(yīng)溫度過(guò)高；配制的試劑或接頭加入0.2ml PCR管的量不夠；清洗時(shí)過(guò)于劇烈以及上反應(yīng)之前混勻時(shí)沒(méi)將氣泡彈凈都可能影響文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)文庫(kù)濃度偏低時(shí)，擴(kuò)增所形成的DNA樣本簇將減少，測(cè)序數(shù)據(jù)量也將減少，可能導(dǎo)致測(cè)序失??；當(dāng)上機(jī)前文庫(kù)濃度過(guò)高時(shí)，文庫(kù)樣本流經(jīng)測(cè)序芯片(Flowcell) 時(shí)將產(chǎn)生過(guò)多的結(jié)合，從而導(dǎo)致樣本簇生成過(guò)密，最終在一級(jí)生物信號(hào)分析時(shí)無(wú)法區(qū)分各簇的熒光信號(hào)，造成測(cè)序失敗。

3.4 樣本開(kāi)始采集時(shí)間可適當(dāng)延后 規(guī)定孕12+0～22+6周采血，是因?yàn)閺娜焉锏?周開(kāi)始才能在孕婦外周血中檢測(cè)出少量的胎兒游離DNA，胎兒游離DNA的濃度隨孕周的增加而升高[7-8]。在12～22周時(shí)，通過(guò)測(cè)序，大多數(shù)孕婦能檢測(cè)到胎兒游離DNA含量較大，為5%～30%。由于個(gè)體差異可能個(gè)別孕婦胚胎含量較低，需要等孕周再大一些再次采血進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室目前沒(méi)有足夠的數(shù)據(jù)量支撐孕12周采血一定不能正常出具檢測(cè)報(bào)告，但是出現(xiàn)過(guò)孕周過(guò)小導(dǎo)致胚胎含量不足，后期需要通過(guò)孕周增加后重新采血重做正常出結(jié)果的情況。妊娠16～24周是做產(chǎn)前診斷的最佳穿刺抽取羊水時(shí)間。由于此時(shí)胎兒較小而羊水較多，胎兒周圍有較寬的羊水帶且浮在羊水中，此時(shí)抽取羊水不易刺傷胎兒，對(duì)子宮腔的影響較小[9]。在不影響后續(xù)診斷的情況下，建議最小孕周可以適當(dāng)增加幾周，此時(shí)能夠檢測(cè)到的胚胎含量相對(duì)來(lái)說(shuō)更多，能切合實(shí)驗(yàn)后期生物信息分析的胚胎含量。隨著分析水平的提高及試劑的優(yōu)化，后期所需的胚胎含量肯定還會(huì)下降，能更早的檢測(cè)胎兒是否患有三大染色體疾病，這是大家共同追求的目標(biāo)，也是對(duì)出生缺陷更好的防治手段。

3.5 外部因素的影響 除了人員實(shí)驗(yàn)操作意外之外，實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫濕度、保存試劑的冰箱溫度也很重要，它直接影響著實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行都需要精確可靠的監(jiān)測(cè)儀器提供準(zhǔn)確的環(huán)境參數(shù)數(shù)據(jù)。主要識(shí)別儀器的需要、試劑的需要、實(shí)驗(yàn)程序的需要及實(shí)驗(yàn)室員工的人性化考慮，因此實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

溫濕度必須控制在溫度18～28℃，濕度20%～80%較為適宜，并每天按時(shí)記錄[10]。不同的試劑儲(chǔ)存的溫度不同，在收到試劑后，放置試劑于對(duì)應(yīng)溫度的冰箱，并監(jiān)測(cè)冰箱溫度的穩(wěn)定性，每天按時(shí)記錄。

3.6 試劑穩(wěn)定性的影響 由于試劑生產(chǎn)批次不同，效能不同，因此不排除試劑穩(wěn)定性、人為操作對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。不同人的操作手法存在略微的差別，可能會(huì)在配制提取/建庫(kù)試劑時(shí)，提取游離DNA清洗過(guò)程中，文庫(kù)構(gòu)建純化過(guò)程中，引起GC偏移。DNA濃度在一定程度上可以反映提取質(zhì)量，以上情況僅針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分析討論，供其他地區(qū)實(shí)驗(yàn)室參考。

國(guó)家衛(wèi)計(jì)委現(xiàn)已取消NIPT試點(diǎn)，制定相關(guān)規(guī)范文件，由此說(shuō)明NIPT項(xiàng)目已步入市場(chǎng)化成熟狀態(tài)。與唐氏篩查相比，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)檢出率高，它應(yīng)用二代測(cè)序，與一代測(cè)序相比提高了測(cè)序通量，與三代測(cè)序相比降低了測(cè)序成本，不僅能應(yīng)用于產(chǎn)前篩查，還能應(yīng)用于單基因遺傳病檢測(cè)、腫瘤靶向治療、臨床藥物基因檢測(cè)等方面，以后肯定有更廣闊的市場(chǎng)。但是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)并不能取代產(chǎn)前篩查，通過(guò)臨床觀察，產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦除了排除唐氏綜合征的同時(shí)，還伴有其他的臟器異常情況也常見(jiàn)。因此，產(chǎn)前篩查，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，產(chǎn)前診斷，產(chǎn)前超聲檢查四者缺一不可[11]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)常交流，提高樣品的DNA提取質(zhì)量和文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率。