張曉偉，金瑛，易東旭，楊立群，張翀，劉丹華，孟勝男

(1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，沈陽 110122；2.遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院，沈陽 110031；3.國家衛(wèi)健委生殖健康與遺傳醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110031)

男性激素避孕是一種非常有潛力的避孕手段，目前已經(jīng)有大量臨床試驗(yàn)證明了其安全性和有效性[1-2]。但是藥物制劑釋放速度不平穩(wěn)導(dǎo)致體內(nèi)激素水平急劇變化帶來的不良反應(yīng)，如情緒變化、痤瘡、性功能障礙等，降低了人們對這種避孕方法的接受度，也成為男性激素避孕手段繼續(xù)發(fā)展的瓶頸[3]。因此，對該類激素相關(guān)藥物的劑型加以改善，降低激素相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率，不僅有助于男性激素避孕手段的繼續(xù)發(fā)展，也有助于改進(jìn)激素補(bǔ)充療法等相關(guān)藥物平臺。植入劑是避孕領(lǐng)域最常見的藥物緩釋劑型，但傳統(tǒng)植入劑制備工藝復(fù)雜，成本高昂，需要在局部麻醉下進(jìn)行外科切口后埋植。如果植入劑為生物不可降解型物質(zhì)，還需額外手術(shù)進(jìn)行清除，使用極為不便，患者順應(yīng)性差[4-5]。

溶劑沉淀型原位凝膠植入劑(solvent-removal precipitation based in situ forming implant，SRP-ISFI)是將高分子聚合物與藥物一同溶解或溶脹于可與水互溶的適宜有機(jī)溶劑中所得可注射制劑[6]。局部注射后，SRP-ISFI中有機(jī)溶劑與生理環(huán)境中的水相互交換，聚合物沉淀凝固形成半固體或固體藥物緩釋貯庫。目前，SRP-ISFI已經(jīng)有多種制劑被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，包括Atridox?、Eligard?等[7-9]。SRP-ISFI克服了傳統(tǒng)植入劑缺點(diǎn)，具有可用于病變部位局部給藥、延長釋藥周期、降低給藥劑量和藥物不良反應(yīng)、避免植入劑手術(shù)植入的痛苦、患者順應(yīng)性好、制備工藝相對簡單等優(yōu)點(diǎn)。

筆者之前采用聚己內(nèi)酯丙交酯制備十一酸睪酮原位凝膠植入劑(testosterone ondecanoate-loaded injectable in situ forming implants，TU-ISFI)，并對該制劑工藝和藥物體外釋放機(jī)制等進(jìn)行初步考察，TU-ISFI可以在體外穩(wěn)定釋放藥物長達(dá)3個月[10]。筆者在本實(shí)驗(yàn)觀察該藥在大鼠體內(nèi)避孕效果及可逆性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 十一酸睪酮(testosterone undecanoate，TU，純度：98%，購自武漢遠(yuǎn)成藥業(yè)有限責(zé)任公司)；TU注射液(浙江仙居制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：180601)；TU-ISFI(本實(shí)驗(yàn)室自行制備[10])。聚己內(nèi)酯丙交酯[poly (DL-lactide-ε-caprolactone)，PLCA，購自山東岱剛生物技術(shù)有限公司，批號：20171110]。其他試劑均為分析純。

8周齡Sprague-Dawley大鼠，雄性體質(zhì)量200～220 g，雌性體質(zhì)量180～200 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼) 2010-0001。本實(shí)驗(yàn)涉及的動物實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容，嚴(yán)格按照中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)相關(guān)政策文件規(guī)定要求執(zhí)行。

1.2TU-ISFI的制備 按20%濃度比例稱取適量PLCA溶于N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone，NMP)，37 ℃攪拌保存過夜，直至得到透明澄清PLCA溶液。將該溶液在65 ℃加熱，除去其中所溶解氣體。分批稱取適量過篩孔內(nèi)徑0.148 mm篩(100目)TU藥粉，分散在PLCA/NMP溶液，攪拌至完全溶解，使最終所得TU-ISFI載藥量16%。

1.3大鼠血藥濃度測定 將雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為給藥組和空白對照組，每組40只，給藥組給予TU-ISFI，空白對照組給予不含藥物的同基質(zhì)同處方原位凝膠注射植入劑。將大鼠麻醉，以20-21號針頭背部皮下注射。注射前后稱重，精密確定給藥劑量。分別于給藥后適當(dāng)時間點(diǎn)隨機(jī)取大鼠5只，尾靜脈取血約0.7 mL。取血后處死大鼠，取出剩余埋植劑，去除包裹組織，蒸餾水洗滌，凍干，甲醇復(fù)溶，浸泡，超聲處理2 h，過濾，高效液相色譜(HPLC)法測定埋植劑中殘余TU量(LA-30A，Shimadzu，日本)。血樣經(jīng)3500 r·min-1離心10 min(r=10 cm)得血漿，-20 ℃冷凍保存。電子發(fā)光法測定其中睪酮含量(cobas e 411，Roche，德國)。

1.4藥效學(xué)動物分組 將雄性大鼠隨機(jī)分為TU-ISFI大、中、小劑量組和十一酸睪酮注射液組(陽性對照組)、空白對照組，每組30只。TU-ISFI大、中、小劑量組分別注射TU-ISFI 600，300，150 mg(相當(dāng)于TU 3.0，1.5和0.75 mg·kg-1·d-1)，空白對照組給予空白原位凝膠植入劑0.3 g，陽性對照組按1.5 mg·kg-1·d-1劑量按月給藥，共注射3次。給藥后1，3，4個月(因TU-ISFI可持續(xù)釋放3個月，給藥后4個月相當(dāng)于停藥1個月)，每組取10只進(jìn)行生育力實(shí)驗(yàn)。

1.5生育力實(shí)驗(yàn) 交配生育實(shí)驗(yàn)：取各組雄性大鼠與12周齡雌性大鼠，按♂：♀=1：2合籠。合籠后每天10：00之前檢測雌性大鼠陰道涂片，陰道涂片內(nèi)出現(xiàn)精子或陰栓時，算一次交配行為。記錄交配情況，將交配過的雌性大鼠編號取出，18 d后處死，記錄子宮內(nèi)存活胎仔及死胎數(shù)。檢測交配行為共進(jìn)行6 d，6 d后未發(fā)現(xiàn)交配行為的雌鼠，也在18 d后處死，觀察懷孕情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束計(jì)算懷孕率、平均胎仔數(shù)、死胎率。

1.5.1生殖系統(tǒng)發(fā)育 雄性大鼠配對結(jié)束后稱重，脫臼處死，解剖，記錄睪丸、附睪和精囊質(zhì)量，計(jì)算生殖器相對質(zhì)量。生殖器相對質(zhì)量=器官質(zhì)量/體質(zhì)量×100。

1.5.2睪丸組織細(xì)胞形態(tài)學(xué) 取新鮮分離的大鼠睪丸組織，Bouin’s固定液固定至少24 h。常規(guī)上行梯度乙醇脫水、石蠟包埋，切取厚度5 μm組織切片。常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察睪丸內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和精子發(fā)生狀況。

1.5.3精子計(jì)數(shù)和精子活動力測定 另取兩側(cè)附睪尾組織各約100 mg，剪碎置15 mL任氏液，37 ℃孵育10 min，使精子在培養(yǎng)液內(nèi)分散均勻。取一滴精子懸液滴在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按照血細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定精子密度，并分別計(jì)算活動精子數(shù)和不活動精子數(shù)，換算成精子活動力百分比和每個附睪中精子總數(shù)。

1.5.4精子形態(tài) 取上述精子懸液30 μL滴在載玻片上，蓋玻片與載玻片呈45度角迅速推膜，制成精液涂片，水平放置10 min，晾干。晾干后浸入95%乙醇與甲醇混合液中固定2～3 min，取出后再次晾干。常規(guī)HE染色，磷酸鹽緩沖液沖洗調(diào)色，高倍顯微鏡下觀察精子形態(tài)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0版軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用單因素方差分析法和t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠體內(nèi)釋放情況 TU-ISFI在血漿中的睪酮濃度-時間曲線見圖1。植入后，給藥組血漿睪酮濃度迅速超過空白對照組，7 d后給藥組血漿睪酮水平開始急劇上升，28 d達(dá)到最大值，然后開始緩慢下降，90 d血漿睪酮濃度與空白對照組持平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TU-ISFI可在3個月內(nèi)持續(xù)維持大鼠體內(nèi)較高血漿睪酮濃度，3個月后大鼠體內(nèi)睪酮水平回落至正常。植入劑殘余藥量測定結(jié)果表明，TU-ISFI在大鼠體內(nèi)藥物突釋量較小，第7天共釋放約14.7%藥物，第28天共釋放約47.3%，第63天累積釋放量達(dá)到89.9%，第90天時基本全部釋放。

圖1 兩組大鼠血漿睪酮濃度變化

2.2交配生育實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表1。給藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組和陽性對照組懷孕率和平均胎仔數(shù)均較空白對照組高，此時外源性睪酮已經(jīng)開始抑制新的精子產(chǎn)生，但由于大鼠精子整個發(fā)生時程為48 d，睪酮主要在精子產(chǎn)生初期發(fā)生作用，因此1個月時還不能達(dá)到避孕效果。大鼠精子發(fā)生周期時程為12 d，整個精子發(fā)生時程為48 d，給藥1個月，因?yàn)椴G丸內(nèi)睪酮水平下降，導(dǎo)致減數(shù)分裂期和精子形成期生精細(xì)胞大量丟失，但對已經(jīng)成熟或者接近成熟的精子不起抑制作用，因此不能達(dá)到完全避孕效果。給藥3個月后，TU-ISFI大、中劑量組可達(dá)到100%成功避孕；TU-ISFI小劑量組避孕成功率75%，懷孕胎仔數(shù)明顯下降；陽性對照組避孕成功率90%，10只雄鼠中有1只雄鼠的兩只配對雌鼠懷孕，未達(dá)到100%避孕效果。停藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組繁殖能力開始恢復(fù)，陽性對照組繁殖能力仍受到抑制。

表1 大鼠交配生育實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.3生殖系統(tǒng)發(fā)育分析 結(jié)果見圖2。給藥后1個月，與空白對照組比較，TU-ISFI大、中、小劑量組生殖器整體相對質(zhì)量增加，睪丸質(zhì)量減輕，精囊增大，附睪無明顯變化；陽性對照組生殖系統(tǒng)整體質(zhì)量下降，睪丸、附睪均縮小，精囊稍增大。給藥后3個月，與空白對照組比較，其他各組生殖系統(tǒng)整體質(zhì)量較低，主要由于睪丸和附睪萎縮，其中TU-ISFI大、中、小劑量組睪丸質(zhì)量約為空白對照組的50%，陽性對照組睪丸質(zhì)量為空白對照組的三分之一。停藥后1個月，TU-ISFI大、中、小劑量組睪丸和附睪大小恢復(fù)較快，陽性對照組生殖系統(tǒng)恢復(fù)較慢。

2.4睪丸組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 結(jié)果見圖3。給藥后1個月，TU-ISFI各劑量組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)各級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子及間質(zhì)細(xì)胞均清晰可辨，未見明顯形態(tài)學(xué)變化；陽性對照組部分曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞蛻變，壞死脫落。給藥后3個月，TU-ISFI大劑量組和陽性對照組大部分曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞明顯減少，排列疏松，層次變薄，腔緣不整齊；精子、精子細(xì)胞及精母細(xì)胞部分蛻變，脫落；部分區(qū)域管腔皺縮，細(xì)胞稀少，腔內(nèi)空虛，近基底膜僅見少許散在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞或支持細(xì)胞，部分僅襯覆幾個精原細(xì)胞，管腔內(nèi)明顯可見多個多核巨細(xì)胞。TU-ISFI中、小劑量組可見局部曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞減少，排列疏松，層次變薄，細(xì)胞稀少，部分腔內(nèi)空虛，近基底膜僅見少許散在的精原細(xì)胞，支持細(xì)胞或蛻化中的精母細(xì)胞亦見多核巨細(xì)胞。與TU-ISFI大劑量組比較，TU-ISFI中、小劑量組形態(tài)學(xué)變化及范圍具有明顯劑量依賴性。

圖2 TU-ISFI對大鼠體質(zhì)量和生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響

停藥后1個月，陽性對照組大部分曲細(xì)精管仍皺縮，生殖細(xì)胞明顯較少，排列疏松，層次變薄，細(xì)胞稀少，腔內(nèi)空虛，近基底膜僅見少許精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及支持細(xì)胞，小部分曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞清晰可見，仍見精子發(fā)生。TU-ISFI大、中、小劑量組可見部分區(qū)域曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞減少，排列疏松，層次變薄。局部曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞蛻變，壞死，脫落，腔內(nèi)空虛，但大部分曲細(xì)精管內(nèi)各級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及正常精子均清晰可辨，間質(zhì)未見明顯形態(tài)學(xué)變化，其形態(tài)學(xué)變化及范圍具有明顯劑量依賴性。

2.5精子計(jì)數(shù)和精子活動力 結(jié)果見表2。給藥后1個月，與空白對照組比較，其他各組精子數(shù)量明顯下降，下降程度依次為：陽性對照組>TU-ISFI大劑量組>TU-ISFI中劑量組>TU-ISFI小劑量組，可能由于外源性睪酮作用，TU-ISFI大、中、小劑量組精子活力與空白對照組相比顯著提高。給藥3個月后，除空白對照組外，其他各組精子數(shù)均極少，TU-ISFI大、中劑量組精子活動力為0，TU-ISFI小劑量組和陽性對照組精子活動能力底下。停藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組精子數(shù)有所恢復(fù)，精子活動率回升至20%以上，陽性對照組仍處于被抑制狀態(tài)。

圖3 5組睪丸組織形態(tài)學(xué)變化(St.睪丸精子細(xì)胞；Sc.精母細(xì)胞；Sg.精原細(xì)胞；G.多核巨細(xì)胞；*.曲細(xì)精管空腔；×400)

2.6精子形態(tài) 給藥1個月時，TU-ISFI中、小劑量組精子形態(tài)未見明顯異常；TU-ISFI大劑量組可見個別異常形態(tài)精子，主要表現(xiàn)為尾部折疊、頭部無鉤等；陽性對照組可見大量異常形態(tài)精子，主要表現(xiàn)為無定形、胖頭等。給藥3個月，陽性對照組出現(xiàn)大量精母細(xì)胞，精子細(xì)胞及精子蛻變、壞死，大量精子出現(xiàn)無頭、斷尾等畸形表現(xiàn)；TU-ISFI大、中、小劑量組出現(xiàn)大量精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子蛻變、壞死，精子形態(tài)學(xué)變化均與陽性對照組相近，程度略低。

停藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組仍可見單個精母細(xì)胞及精子細(xì)胞蛻變、壞死，精子形態(tài)大部分完好，畸形率較低，形態(tài)學(xué)變化與給藥1個月時相近；陽性對照組可見部分蛻變壞死精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子，部分精子畸形，主要是無鉤、胖頭、斷尾等。

3 討論

我國曾開展過TU注射液用于男性激素避孕的臨床多中心研究，該研究中，TU在男性避孕方面的有效性得到肯定，但在不良反應(yīng)發(fā)生率以及安全性方面存有質(zhì)疑。此外，部分受試者希望能夠有更長效的TU制劑[11]。

表2 5組不同時間附睪精子數(shù)和精子活動率

圖4 5組精子形態(tài)變化(Sp.精子；WBC.白細(xì)胞；ab-SP.畸形精子；d-Sc.退變壞死的精母細(xì)胞；×400)

本研究結(jié)果表明，給藥1個月后，TU-ISFI各劑量組精子數(shù)有所下降，但精子活動力上升，因此母鼠妊娠率較空白對照組高。大鼠精子發(fā)生周期時程為12 d，整個精子發(fā)生時程為48 d，給藥1個月時，因?yàn)椴G丸內(nèi)睪酮水平下降，導(dǎo)致減數(shù)分裂期和精子形成期生精細(xì)胞大量丟失，但對已經(jīng)成熟或者接近成熟的部分精子起不到抑制作用，因此不能達(dá)到完全避孕效果。給藥3個月后，各劑量組均達(dá)到抑制精子發(fā)生效果，在避孕效果上，TU-ISFI大、中劑量組優(yōu)于陽性對照組，避孕率達(dá)到100%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予大鼠小劑量TU并不能對睪丸本身合成和分泌睪酮的功能實(shí)現(xiàn)完全干擾，仍有極少部分有活力精子產(chǎn)生，導(dǎo)致避孕失敗。從停藥1個月后恢復(fù)情況看，由于后期TU-ISFI釋放藥物量逐漸降低，避免了陽性對照組每個月一次給藥帶來的波谷現(xiàn)象，有利于停藥后精子數(shù)目和精子活力恢復(fù)。

綜上所述，TU-ISFI以300～600 mg劑量(即1.5～3.0 mg·kg-1·d-1劑量TU)對大鼠給藥后可達(dá)到優(yōu)于陽性對照組的避孕效果，停藥后大鼠生殖能力可迅速恢復(fù)。后續(xù)研究中，筆者還將考察其安全性和不良反應(yīng)發(fā)生情況，對其劑量進(jìn)一步篩選。從目前研究來看，TU-ISFI具有平穩(wěn)藥物緩控釋能力，對雄性大鼠避孕效果優(yōu)良，作用更為溫和并且可靠，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的激素補(bǔ)充制劑和男性避孕制劑。