鄭慧怡，馬芙蓉，羅曉清，張 瑜，金盈圻，賀慶芝

(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院,湖南 衡陽 421001;2.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院,廣西 桂林 541199)

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一種慢性炎性、特發(fā)性和復(fù)發(fā)性的胃腸道疾病。臨床上，IBD主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)。雖然引起IBD的具體機制尚不十分清楚，但有人認為免疫、遺傳和環(huán)境因素可能在疾病發(fā)病中起到很重要的作用[1]。在生理條件下，腸道共生菌群定植于胃腸道，對腸道黏膜屏障、代謝和免疫調(diào)節(jié)等功能發(fā)揮積極作用，同時一些病原微生物也能潛伏在腸道，對腸道構(gòu)成一定威脅，因此，消化系統(tǒng)能夠平衡共生菌和病原菌的免疫反應(yīng)，以保持腸道穩(wěn)態(tài)[2]。最近有文獻報道，腸道菌群失調(diào)可以誘導(dǎo)腸道免疫應(yīng)答的失調(diào)，最終導(dǎo)致腸炎的發(fā)生[3]。牛初乳(bovine colostrum,BC)是一種富含多種抗菌肽、生長因子和免疫調(diào)節(jié)因子的牛奶，對胃腸道的功能有著重要的保護作用[4]。牛初乳的功能主要體現(xiàn)在：提供必需的營養(yǎng)成分，加強自然防御系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫反應(yīng)，促進組織的生長、成熟和修復(fù)[5]。牛初乳和牛初乳衍生產(chǎn)品已被用于預(yù)防和治療多種胃腸道疾病[6]，但其具體調(diào)節(jié)機制尚不十分清楚。為了驗證“牛初乳通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎”這一推測，本研究擬用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)構(gòu)建C57BL/6J小鼠腸炎模型，監(jiān)測其體重和腸炎評分的變化，同時應(yīng)用HE染色及結(jié)腸組織病理評分觀察牛初乳對小鼠腸炎的影響；實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,QPCR)監(jiān)測腸道菌群中常見微生物的含量，初步探討牛初乳抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的可能分子機制。該項目的完成可為腸炎的防治提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

所有C57BL/6J小鼠均購于南京君科生物工程有限公司，牛初乳購自Qiagen公司，DSS購于美國MPBio公司，DNA提取試劑盒購于Qiagen公司，SYBR Green PCR試劑盒購于美國ABI公司，引物由上海生工合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立腸炎模型 將20只5～6周齡雌性C57BL/6J小鼠隨機分為四組，即對照組(5只)、BC組(5只)、2%DSS組(5只)和BC+2%DSS組(5只)。BC組、BC+DSS組通過灌胃法每天接受含有牛初乳的懸浮液(牛初乳飼養(yǎng)量0.23 mg/g體重)，對照組、DSS組小鼠接受等體積的0.9%鹽水溶液，持續(xù)21天。按照參考文獻[7]的方法建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，即將葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量為36 000～50 000)溶于蒸餾水中，配制成2%的DSS溶液；從牛初乳灌胃21天后開始連續(xù)給予DSS組、BC+DSS組小鼠7天2%DSS自由飲水，即可建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。

1.2.2 稱重 從給予DSS前一天(D0)開始每天固定時間稱量各組小鼠體重，以D0的體重為基數(shù)。

1.2.3 腸炎疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評估 從給予DSS前一天開始每天固定時間觀察小鼠體重、糞便性狀和便血情況，按照以下標準對小鼠進行評分，將小鼠體重、糞便性狀和便血情況的評分相加即小鼠的DAI分值，以評估腸炎疾病的嚴重程度。評分標準如下：(1)體重改變評分標準(0～4分)：小鼠體重下降0%～1%被評為0分；下降1%～5%被評為1分；下降5%～10%被評為2分；下降10%～20%被評為3分；下降20%以上被評為4分。(2)糞便性狀評分標準(0～4分)：正常糞便0分；軟便1分；稀便2分；腹瀉4分。(3)血便評分標準(0～4分)：正常糞便0分；糞便表面有血跡2分；嚴重出血4分。將以上3個分數(shù)相加即DAI的分值。

1.2.4 HE染色和結(jié)腸組織病理學(xué)評分(Histopathological score,HS) 取結(jié)腸組織并去除腸內(nèi)容物后置于10%中性甲醛溶液中固定，循著包埋(石蠟)-切片-染色(HE)-脫水(酒精)-逐級脫水-透明(二甲苯)-封片(中性樹膠)的步驟，最后在光鏡下觀察腸道黏膜充血、上皮細胞脫落壞死及炎癥細胞浸潤等病理變化，并按如下標準進行結(jié)腸組織病理評分：(1)潰瘍評分標準(0～2分)：小鼠結(jié)腸組織中無潰瘍被評為0分；有小潰瘍(<3 mm)被評為1分；有大潰瘍(>3 mm)被評為2分。(2)炎癥評分標準(0～2分)：無炎癥0分；輕度炎癥1分；重度炎癥2分。(3)肉芽腫評分標準(0～1分)：無肉芽腫0分；有肉芽腫1分。(4)病變深度評分標準(0～3分)：無病變0分；有病變且至黏膜下層1分；有病變且至肌層2分；有病變且至漿膜層3分。(5)纖維化評分標準(0～2分)：無纖維化0分；輕度纖維化1分；重度纖維化2分。將以上5個分數(shù)相加即病理學(xué)評分分值。

1.2.5 QPCR檢測 實驗結(jié)束后，按照Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取糞便中的DNA,通過QPCR監(jiān)測小鼠糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的DNA含量(引物[8-10]見表1)。QPCR反應(yīng)體系：2×QPCR Mix 5.0 μL，引物工作液(2.5 μmol/L)0.8 μL，探針0.2 μL，DNA模版2.0 μL，ddH2O 2.0 μL，總體積10 μL，每個樣本均做3復(fù)孔，QPCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。

表1 大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的基因引物

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，運用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，均數(shù)之間的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牛初乳抑制DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠體重下降

對照組和BC組小鼠的體重平穩(wěn)上升，兩組差異無顯著性(P>0.05)；DSS組小鼠的體重在第3天(D3)后呈現(xiàn)顯著性降低的趨勢，與對照組相比差異有顯著性且差異持續(xù)增大，在第10天(D10)下降到最低值，體重下降了約23.5%；BC+DSS組小鼠的體重也在D3后呈現(xiàn)顯著性降低的趨勢，但在第8天(D8)下降到最低值，下降了約15%，并在之后的幾天里體重呈現(xiàn)顯著性增加的趨勢，在第11天(D11)時接近給予DSS前一天時的體重。與DSS組比較，BC+DSS組在D8出現(xiàn)顯著性差異且差異持續(xù)增大(P<0.01)；而與對照組相比，BC+DSS組在D8后差異顯著性降低(P<0.01)。結(jié)果顯示：牛初乳能抑制DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠體重下降(圖1)。

圖1 牛初乳對DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠體重的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

2.2 牛初乳降低DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎疾病評分

對照組和BC組小鼠沒有發(fā)生腸炎，其疾病評分始終為0分；DSS組小鼠從給予DSS后第二天起腸炎評分不斷上升，在第7天達到峰值約2.5分后有所下降并趨于穩(wěn)定；BC+DSS組從第3天起小鼠腸炎評分不斷上升，在第7天達到峰值2.3分，但從第8開始，小鼠腸炎評分呈顯著性下降到接近對照組水平。結(jié)果顯示(圖2)：牛初乳降低DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎疾病評分。

圖2 牛初乳對DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎疾病評分的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

2.3 牛初乳修復(fù)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織損傷

小鼠牛初乳灌胃21天后，給予2%DSS飲水，持續(xù)7天，HE染色結(jié)果顯示(圖3)：對照組和BC組小鼠結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層腸腺豐富，排列規(guī)則，黏膜下層以及肌層未見明顯異常；DSS組小鼠局部腸柱狀上皮細胞點狀壞死，胞核固縮深染(黑色箭頭)，固有層腸腺減少消失，被肉芽組織取代，并伴有較多炎性細胞浸潤(紅色箭頭)，中性粒細胞為主，損傷侵及黏膜下層，黏膜下層中也可見少量炎性細胞(黃色箭頭)；BC+DSS組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本完整，黏膜層中偶見小灶性的炎性細胞浸潤，其余未見明顯改變。結(jié)腸組織病理學(xué)評分結(jié)果(圖4)：對照組和BC組均為0；DSS組[(6.05±1.03)分]與BC+DSS組[(1.33±0.54)分]比較，差異有顯著性，P<0.01。牛初乳能顯著性減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

2.4 牛初乳改善DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)

實驗結(jié)束后通過QPCR檢測小鼠糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的DNA含量變化，結(jié)果顯示(圖5)：BC組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌含量與對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)；DSS組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌含量較對照組顯著性增加，而雙歧桿菌和乳酸桿菌含量顯著性減少(P<0.01)；BC預(yù)處理后再用DSS誘導(dǎo)的小鼠(即BC+DSS組)大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌含量與DSS組比較，均顯著性恢復(fù)，接近對照組及BC組的水平。牛初乳改善DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種非特異性炎癥性疾病，屬于炎癥性腸病的一種。病變部位多為乙狀結(jié)腸和直腸，也可延伸至結(jié)腸，嚴重者蔓延到整個結(jié)腸。該病病程長，反復(fù)發(fā)作，若得不到及時的治療，長期發(fā)展下去極易發(fā)生癌變[11]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來其發(fā)病率逐年上升，雖然免疫抑制劑能在一定程度上控制部分患者的病情，但其價格昂貴且副作用強[12]。因此研究其發(fā)病與防治機制并尋找新的治療手段是該病領(lǐng)域中急需解決的問題。

圖3 牛初乳對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)的影響(10×,HE)(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

圖4 牛初乳對DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道組織病理學(xué)評分的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

圖5 牛初乳對DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

引起UC的致病因素極其復(fù)雜，至今尚不十分清楚。文獻報道UC的發(fā)病可能與腸道菌群的異常反應(yīng)、疾病進程中的環(huán)境因素以及遺傳學(xué)傾向有關(guān)。正常情況下保護性免疫和腸道菌群之間的相互作用使腸道處于穩(wěn)定平衡狀態(tài)，即腸道穩(wěn)態(tài)。各種原因引起的腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能變化(腸道菌群失調(diào))，是導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)被打破的重要原因之一，該穩(wěn)態(tài)一旦被打破，會導(dǎo)致腸道功能失調(diào)，從而形成腸炎。Nishino K等人[13]證實，腸炎患者的腸道菌群失調(diào)，腸道內(nèi)變形菌門細菌較正常人顯著增多，但厚壁菌門和擬桿菌門細菌顯著減少。

牛初乳(bovine colostrum,BC)是一種純天然食品，是指在牛分娩一周內(nèi)所產(chǎn)生的乳汁。牛初乳較普通乳汁除了能夠提供更高含量的營養(yǎng)化學(xué)物質(zhì)外，還含有許多特殊的生物活性成分，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、生長因子、激素、細胞因子、脯氨酸多肽、溶菌酶等，這些生物活性物質(zhì)是牛初乳的精華所在。牛初乳作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，可減輕腹瀉[14]，改善小鼠結(jié)腸炎[15]。口服牛初乳粉溶液，可以降低巨結(jié)腸大鼠模型發(fā)生腸炎的概率，且對巨結(jié)腸大鼠有預(yù)防腸炎發(fā)生的作用；牛初乳還可通過修復(fù)腸上皮損傷，降低炎癥細胞因子和一氧化氮的表達，從而逆轉(zhuǎn)慢性結(jié)腸炎[16]。且Filipescu IE等人[17]研究證實，BC給藥耐受性良好，并不會引起健康小鼠體重的降低、腸炎疾病評分、腸組織炎性的損傷及腸道微生物的變化，因此可以確定BC的安全性和本實驗結(jié)果的有效性。本研究前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛初乳能夠治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，對DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠體重降低、腸炎疾病評分、腸組織炎性損傷等有顯著性的修復(fù)改善作用，這與文獻報道完全一致，證實了牛初乳可保護腸道、減輕腸道炎癥程度。為了進一步探究牛初乳對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用是否與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)，本課題組通過QPCR檢測了腸道菌群中大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DSS組(與對照組比較)小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌含量顯著性增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌含量顯著性減少；BC+DSS組(與DSS組比較)大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌含量均顯著性恢復(fù)，幾乎接近對照組的水平。這證實牛初乳對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。

綜上所述，牛初乳對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有一定的改善作用，其改善作用可能與腸道菌群有關(guān)，但由于牛初乳成分復(fù)雜，對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用是多方面的，可能包括調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、增強黏膜屏障功能等方面，目前尚不能用單一理論解釋牛初乳對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制，這還有待進一步研究及探討。