徐慶東，郭煥開，蘇 明，陳潔欣，馬惠娟，鄧繼鴻，姜松青，石曉峰

(江門市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 江門 529000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病機制尚未完全清楚，臨床療效不甚理想，因此，進一步探索DN發(fā)病機制，尋求新的有效的防治措施對治療DN具有重要意義。腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubular interstitial fibrosis，RTIF)是DN的主要病理變化之一[1]，臨床研究和動物實驗證實，DN的發(fā)病進程中，腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)通過特定程序轉化為間質(zhì)表型細胞，即上皮細胞間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)使細胞外基質(zhì)大量沉積，引起腎小管間質(zhì)纖維化、變性、萎縮、消失[2]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因編碼的蛋白具有抗纖維化效應[3]，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(eroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)能在轉錄水平調(diào)控PTEN，延緩DN進展[4]。本研究通過探索糖尿病小鼠及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN的表達變化，擬進一步完善PPARγ、PTEN與糖尿病的EMT和腎纖維化的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

C57BL小鼠，SPF級，體質(zhì)量為(30±5)g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)購自上海斯信生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自Sigma(美國)公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自北京索萊寶科技有限公司；兩步法免疫組化檢測試劑盒購自cell signaling technology(CST)公司；4%多聚甲醛(polyformaldehyde，PFA)磷酸緩沖液、中性樹膠封片劑購自上海生工生物工程股份有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma(美國)公司；雙花扁豆凝集素(dolichos bifows agglutinin，DBA)試劑盒、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、低分子量蛋白Marker、RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒為賽默飛世爾科技產(chǎn)品。一抗鼠抗β-actin、一抗兔抗PPARγ、一抗兔抗PTEN、兔抗E-cadherin、鼠抗α-SMA、兔抗CollagenⅢ、二抗生物素標記羊抗兔、二抗羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG)等抗體均購自上海生工生物工程股份有限公司；實時熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾科技公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設計完成。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將本室凍存的NRK-52E大鼠腎細胞株，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，48 h換液一次，取對數(shù)期細胞進行實驗。

1.3.2 細胞分組 根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，將細胞分為正常糖量的對照組和高糖量的實驗組，在2% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，對照組的葡萄糖濃度為5.5%；實驗組的葡萄糖濃度為25%，分別在6孔板中培養(yǎng)細胞48 h，然后，分別用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time fluorescent quantitative polymerase reaction，qRT-PCR)測定目標蛋白和基因的表達。

1.4 糖尿病(DM)小鼠模型的構建

STZ溶于無菌的pH4.5，0.01 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，腹腔注射給予C57BL小鼠STZ溶液55 mg/kg，連續(xù)注射5天，第5天注射給藥后72 h，空腹測血糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽性即為糖尿病小鼠(實驗組)。

另取正常小鼠10只作為對照組，腹腔注射無菌pH4.5、0.01 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)注射5天，第5天注射給藥后72 h，空腹測血糖。實驗期間兩組小鼠均正常飲食飲水，連續(xù)喂養(yǎng)8周，處死小鼠，取腎臟，一側腎臟固定于4% PFA溶液中制作石蠟切片，進行病理檢查、免疫組化檢測。另一側腎臟加入生理鹽水研磨，提取總蛋白和RNA，進行Western Blot、qRT-PCR檢測。

1.5 腎組織病理學檢測

腎組織用中性甲醛固定制成石蠟切片，分別用蘇木精-伊紅(Hatmatoxylin-Eosin，HE)、高碘酸-無色品紅(periodic acid solferino，PAS)、Masson、高碘酸烏洛托品銀(periodic acid-silver-methenamine，PASM)進行染色，染色步驟嚴格按照試劑盒要求進行，光鏡下觀察腎組織形態(tài)結構變化及纖維化情況。

1.6 Western blot檢測

取兩組小鼠腎組織和腎小管上皮細胞，提取總蛋白，Western blot檢測PPARγ、PTEN蛋白、EMT蛋白、α-SMA，CollagenⅢ、E-cadherin蛋白表達情況。

1.7 qRT-PCR檢測

取兩組小鼠腎組織和腎小管上皮細胞，提取RNA，qRT-PCR檢測PPARγ、PTEN mRNA表達情況。PPARγ引物：上游為5′-CGCAGTTCTGAGCUGGCGACT-3′，下游為5′-TGGACAGACCCGAACTGATGG-3′；PTEN引物：上游為5′-CTTAAGTTCAGTCCGGAACTTG-3′，下游為：5′-GGCATCAGCATGGAACTAGAC-3′，內(nèi)參引物：5′-GAATGCTGACTGGGAAATTGAG-3′，下游為：5′-ACATTCATCATGGCAGTAACT-3′。反應條件：95 ℃反應10 min后，在95 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，共循環(huán)40次，重復3次，所得試驗數(shù)據(jù)采用RQ=2-△△Ct計算PPARγ、PTEN mRNA表達情況。

1.8 熒光素酶檢測PPARγ轉錄活性

氧化酶體增殖物反應原件熒光素酶報告質(zhì)粒(Addgene plasmid 1015)由本實驗室保存，取兩組腎組織及腎小管上皮細胞，培養(yǎng)24 h后將相同數(shù)量各組系膜細胞裂解，加反應底物，檢測熒光強度，將熒光強度進行對數(shù)轉換后統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 兩組小鼠腎組織病理變化

如見圖1所示，腎組織分別用HE、PAS、PASM染色，對照組小鼠腎小球及基底膜形態(tài)完整、結構清晰，腎小管未出現(xiàn)擴張、壞死、硬化等現(xiàn)象。實驗組小鼠腎小球系膜增生、出現(xiàn)同心圓狀的結節(jié)狀硬化。腎小管管腔擴張、上皮細胞腫脹、變性、呈空泡狀，基底膜不規(guī)則增厚，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，腎小管間質(zhì)區(qū)PAS染色陽性物質(zhì)增多。Masson染色顯示，對照組未出現(xiàn)膠原沉積，實驗組小鼠腎小管管腔明顯擴張、腎小球及腎間質(zhì)見大量被染成藍紫色條索狀的膠原纖維沉積。

圖1 兩組小鼠腎組織HE、PAS、Masson、PASM染色(400×)

2.2 小鼠腎組織及腎小管上皮細胞中PPARγ、PTEN蛋白的表達

Western Blot顯示，與對照組比較，實驗組腎組織及及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN蛋白表達水平顯著降低(P<0.01，見圖2)。

2.3 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細胞中PPARγ、PTEN mRNA的表達

qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，實驗組腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN mRNA表達水平顯著降低(P<0.01，見圖3)。

圖2 兩組小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN蛋白表達水平A：電泳圖，B：PPARγ、PTEN與β-actin比值的相對密度圖；與對照組比較，*P<0.01

圖3 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細胞中PPARγ、PTEN mRNA表達水平與對照組比較，*P<0.01

2.4 小鼠腎組織EMT及纖維化

Western Blot顯示，與對照組比較，實驗組腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細胞中的E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平顯著增高(P<0.01，見圖4)。

2.5 小鼠腎組織及及腎小管上皮細胞PPARγ轉錄活性

與對照組比較，實驗組腎組織及及腎小管上皮細胞PPARγ轉錄活性均明顯增高(P<0.01)，見圖5。

圖4 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細胞E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平A：電泳圖，B：三種檢測蛋白與β-actin比值的相對密度圖；與對照組比較，*P<0.01

圖5 兩組小鼠腎組織及及腎小管上皮細胞PPARγ轉錄活性與對照組比較，*P<0.01

2.6 PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達的相關性

對體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞中PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達量相關性進行分析，PTEN與PPARγ及E-cadherin呈顯著正相關，與α-SMA、Collagen-Ⅲ呈顯著負相關，見表1。

表1 PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達的相關性分析

3 討 論

PTEN基因定位于人類第十號染色體上[5]，該基因能編碼具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重特異性磷酸酶，是一種雙重活性抑癌基因[6]。過往對PTEN的研究主要集中于腫瘤，能參與調(diào)控多條信號通路及細胞周期蛋白通路，發(fā)揮抑制細胞增殖、遷移、黏附、誘導細胞凋亡，抑制血管生成等作用[7]。文獻報道，PTEN是足細胞胰島素敏感性調(diào)控的關鍵分子之一，是引發(fā)DN的重要因子[8]。DN發(fā)病時，PTEN表達降低，與腎組織纖維化密切相關[9]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一種核轉錄因子[10]，是核受體超家族成員，有α、β、γ三種亞型[11]。其中，PPARγ在腎小球、近曲小管、腎臟纖維細胞等組織中有廣泛表達[12]，研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠模型中，PPARγ能直接降低尿蛋白而不降低血糖[13]。而且，PPARγ通過與PTEN上游的過氧化物酶體增生物反應元件結合，參與PTEN的調(diào)控[14]。本實驗結果顯示，經(jīng)高糖處理后，DN小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN的蛋白及mRNA表達水平均較正常小鼠顯著降低，提示高糖不僅使PPARγ表達水平降低，還降低PTEN的表達水平，且蛋白和mRNA降低水平和趨勢相同。有文獻報道，PPARγ轉錄活性在系膜細胞表型轉化中具有重要作用，與DN發(fā)生發(fā)展密切相關，而高糖可抑制PPARγ轉錄活性。本文結果顯示，DN小鼠腎組織及及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞，PPARγ轉錄活性均明顯低于對照組。

Iwano等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，36%的間質(zhì)成纖維細胞來源于RTECs，說明間質(zhì)成纖維細胞的重要來源是EMT。EMT發(fā)生時，EMT的標志性蛋白表達發(fā)生改變，如波形蛋白(Vimentin)被激活，α-SMA表達增加，E-cadherin表達減少[16]。本研究結果顯示，正常小鼠腎組織和腎小管上皮細胞中的E-cadherin蛋白表達水平較高，α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平較低，DN小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細胞中的E-cadherin蛋白表達水平顯著低于對照組，而α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平顯著高于對照組，提示高糖能促進EMT的進展，促進腎組織和腎小管上皮細胞纖維化。對小鼠腎組織進行HE、PAS、PASM、Masson染色發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實驗組小鼠腎小球系膜增生、出現(xiàn)同心圓狀結節(jié)狀硬化；腎小管管腔擴張、上皮細胞腫脹、變性、呈空泡狀，基底膜不規(guī)則增厚，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，腎小管間質(zhì)區(qū)PAS染色陽性物質(zhì)增多，小鼠腎小管管腔明顯擴張，腎小球及腎間質(zhì)見大量被染成藍紫色條索狀的膠原纖維沉積，提示在發(fā)生EMT時，確實發(fā)生了腎小管間質(zhì)纖維化。對腎小管上皮細胞中PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達量的相關性分析結果表明，PTEN與PPARγ(r=0.71)及E-cadherin(r=0.62)的表達呈正相關，與α-SMA(r=-0.66)、Collagen-Ⅲ(r=-0.59)的表達呈顯著負相關，這與文獻報道一致[17]。

綜上所述，機體在高糖的環(huán)境中，腎組織和腎小管上皮細胞中的PPARγ與PTEN的表達水平顯著降低，E-cadherin，上調(diào)α-SMA、Collagen-Ⅲ的表達下調(diào)，腎組織出現(xiàn)EMT及纖維化改變。其機制有待于進一步研究。