楊 倩，劉 媛，李威威

(保定市第一中心醫(yī)院 1.眼三科，2.眼二科，河北 保定 071000)

糖尿病視網膜病變是2型糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥，可導致視力永久性喪失[1]。近年來，伴隨我國2型糖尿病發(fā)病率的增加，2型糖尿病視網膜病變的發(fā)病率也隨之增加，已嚴重影響人們的健康及正常生活[2]。有研究表明[3]，糖尿病患者視網膜對高糖及低氧刺激敏感，進而誘發(fā)促血管生成和抑制血管生成的失衡，最終導致視網膜病變。目前，臨床常用激光手術及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制劑治療2型糖尿病視網膜病變，但二者均對視網膜神經細胞有一定傷害[4]。因此，研發(fā)傷害性較低的用于治療2型糖尿病視網膜病變的藥物具有重要意義。蝦青素是唯一能通過血腦屏障的一種類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界中[5]。相關研究表明[6-7]，蝦青素具有較強的抗氧化作用，可以有效清除細胞內氧自由基，對心血管疾病、糖尿病等疾病的預防及治療有一定作用。既往研究表明蝦青素對糖尿病腎病有一定的保護作用[8]，可通過上調核因子E2相關因子和NAD(P)H醌氧化還原酶1(nicotinamide quinone oxidoreductase 1,NQO1)抑制高糖誘導的氧化應激反應，從而發(fā)揮其保護作用。但是對于2型糖尿病視網膜病變的作用還有待探討，因此，本實驗探討蝦青素對2型糖尿病大鼠視網膜病變的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠70只，SPF級，8周齡，體重質量220～230 g，購自于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-0008。適應性飼養(yǎng)1周。按照2006版《關于善待實驗動物的指導性意見》對實驗動物進行處理。

1.2 試劑與儀器

蝦青素(HPLC≥98%，上海北諾生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素(大連美侖生物技術有限公司)；活性氧(ROS)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(上海奧陸生物科技有限公司)；VEGF抗體和色素上皮衍生因子(PEDF)抗體(美國abcam公司)；Tecan Freedom EVOlyzer?全自動酶免工作站(帝肯(上海)貿易有限公司)；日立7100全自動生化分析儀(廣州東林生物科技有限公司)；DYCP-31C型電泳儀及配套電泳槽(北京六一公司)等。

1.3 模型構建[9]

70只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機選取60只大鼠，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ 30 mg/kg)并持續(xù)高糖高脂飼料飼養(yǎng)構建2型糖尿病大鼠模型。10只正常組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)。造模后第五天，檢測各組大鼠血糖，若血糖>16.7 mmol/L則2型糖尿病大鼠造模成功。其中30只大鼠造模成功，30只大鼠造模失敗，予以剔除。所有大鼠自由飲水、檢測血糖，每2周進行一次眼底檢查，2型糖尿病大鼠視網膜出現新生血管即2型糖尿病視網膜病變大鼠模型成功。將2型糖尿病視網膜病變造模成功的30只大鼠隨機分為3組：模型組、低劑量實驗組、高劑量實驗組，每組各10只。低劑量實驗組大鼠給予蝦青素15 mg/kg灌胃處理，高劑量實驗組大鼠給予蝦青素30 mg/kg灌胃處理，給藥劑量參照相關文獻[2]。模型組及正常組大鼠均給予同等劑量生理鹽水。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 視網膜組織HE染色 取每組10只大鼠左眼視網膜組織，行HE染色。采用腹腔注射戊巴比妥鈉(0.3 g/100 g)麻醉大鼠并處死，摘取眼球浸入眼球固定液中固定，取視網膜組織，依次石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，然后進行HE染色，觀察視網膜組織病理變化。

1.4.2 視網膜組織中ROS、CAT和SOD水平檢測 取每組10只大鼠右眼視網膜組織，研磨成組織勻漿，3 500 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取離心后上清液，-20 ℃冰箱中保存，待驗。采用免疫沉淀法檢測視網膜組織中ROS、CAT和SOD水平，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4.3 視網膜組織中PEDF和VEGF水平檢測 用蛋白質免疫印跡法[10]檢測視網膜組織中PEDF和VEGF水平。步驟如下：取實驗1.4.2中組織勻漿至試管中，首先加入RIPA裂解液用于提取組織中總蛋白；而后用BCA蛋白定量試劑盒進行PEDF及VEGF定量檢測。具體過程：80 V凝膠電泳15 min，電壓增加至120 V，直至溴酚藍跑出膠面；轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加一抗，4 ℃環(huán)境下孵育過夜；滴加二抗，室溫下孵育2 h；曝光顯影，用Image J1.8.0軟件分析實驗結果。

1.5 統計方法

用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組視網膜組織病理變化

由圖1可知，正常組大鼠視網膜組織結構清晰，內、外核層細胞排列規(guī)則，未見新生血管生成；模型組視網膜組織結構不清晰，神經纖維層伴水腫，內、外核層細胞排列疏松，有新生血管生成；低、高劑量實驗組視網膜組織結構較清晰，內、外核層細胞排列較整齊，新生血管生成均較模型組有明顯改善，且高劑量實驗組改善效果優(yōu)于低劑量實驗組。

圖1 各組視網膜組織病理切片(HE，40×)A：正常組；B：模型組；C：低劑量實驗組；D：高劑量實驗組

2.2 各組視網膜組織中ROS、CAT和SOD水平比較

四組視網膜組織中ROS、CAT和SOD水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組視網膜組織中ROS水平升高，CAT和SOD水平降低(P<0.05)。與模型組比較，低、高劑量實驗組視網膜組織中ROS水平降低，CAT和SOD水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；此外，高劑量實驗組ROS、CAT和SOD水平改善程度優(yōu)于低劑量實驗組(P<0.05)。見表1。

表1 四組ROS、CAT和SOD水平比較

2.3 各組視網膜組織中PEDF和VEGF水平比較

由表2、圖2可知，四組視網膜組織中PEDF和VEGF水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組視網膜組織中PEDF水平降低，VEGF水平升高(P<0.05)。與模型組比較，低、高劑量實驗組視網膜組織中PEDF水平升高，VEGF水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。高劑量實驗組視網膜組織中PEDF水平高于低劑量實驗組(P<0.05)，VEGF水平低于低劑量實驗組(P<0.05)。

表2 四組PEDF和VEGF水平比較

圖2 四組PEDF和VEGF蛋白表達A：正常組；B：模型組；C：低劑量實驗組；D：高劑量實驗組

3 討 論

糖尿病是由遺傳、環(huán)境及生活方式等多種誘因引起的以高血糖為特征的代謝性疾病[11]。糖尿病還會產生的并發(fā)癥有糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等[12]。蝦青素在糖尿病腎病中的保護作用已有研究，但是蝦青素對于糖尿病視網膜病變的作用鮮有報道。本實驗通過高糖高脂飼料飼養(yǎng)并腹腔注射鏈脲佐菌素構建2型糖尿病大鼠模型，通過觀察蝦青素干預后糖尿病大鼠視網膜組織病理變化、氧化應激及血管新生等相關指標，探究其對糖尿病視網膜病變的保護作用，為蝦青素臨床應用奠定基礎。

本研究結果顯示，模型組大鼠視網膜組織結構不清晰，神經纖維層伴水腫，內、外核層細胞排列疏松，有新生血管生成，該結果表明2型糖尿病視網膜病變大鼠模型造模成功。給予蝦青素干預后，低、高劑量實驗組視網膜組織結構及內、外核層細胞排列均較模型組有所改善，提示蝦青素對2型糖尿病視網膜病變有較好的治療作用，可修復高糖誘導的視網膜病變，且隨蝦青素給藥劑量增加，其改善效果越為明顯。

最近研究發(fā)現蝦青素有較強的抗氧化能力[13-15]。ROS是脂質過氧化的終產物，檢測ROS水平可了解膜脂過氧化的程度[16]。SOD同樣能夠反映細胞的氧化應激水平[17]。CAT是存在于機體內的一種重要的過氧化物分解酶，可使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，發(fā)揮保護細胞膜的結構和功能[18]。本研究結果顯示：與正常組比較，模型組視網膜組織中ROS水平升高，CAT和SOD水平降低。給予蝦青素干預后，低、高劑量實驗組視網膜組織中ROS水平降低，CAT和SOD水平升高，該結果表明蝦青素可有效改善高糖及低氧誘導的氧化應激損傷，提高組織內抗氧化應激酶CAT和SOD水平，發(fā)揮保護視網膜組織細胞免受氧化應激損傷。

PEDF是絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因家族的成員，能夠產生很強的新生血管抑制作用，同時是細胞外神經營養(yǎng)因子，對神經組織的發(fā)育和生長有重要作用[19]。糖尿病視網膜病變發(fā)病機制是視網膜缺血、缺氧造成眼內VEGF大量表達，VEGF會與高親和力受體結合從而介導血管內皮細胞增殖，導致新生血管形成[20]。本研究給予蝦青素干預后，低、高劑量實驗組視網膜組織中PEDF水平升高，VEGF水平降低，且隨蝦青素給藥劑量增加，其改善效果越明顯。上述結果說明蝦青素可有效通過上調PEDF表達，下調VEGF表達抑制視網膜新生血管生成，從而保護視網膜組織細胞免受損傷。

綜上所述，蝦青素可有效改善糖尿病大鼠視網膜病變，其機制可能與調控PEDF和VEGF表達，抗氧化應激有關。