楊忠敏，沈以紅，王祖文，黃先智，丁曉雯,

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400716；2.西南大學科技處，重慶 400716）

正常生理狀況下，機體會產(chǎn)生少量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），在抗氧化劑的作用下維持氧代謝平衡，對促進細胞增殖分化、激活轉錄因子、調(diào)控某些生理活性物質等具有重要的生理意義[1]。當細胞受到外源性或內(nèi)源性因素刺激后，使機體氧化劑的生成異常增加，導致內(nèi)源性抗氧化劑相對不足，進而發(fā)生氧化應激[2]。腎臟參與了機體水、電解質及酸堿平衡調(diào)節(jié)和多種生物活性物質分泌等重要功能，是重要的排泄器官[3]。機體發(fā)生氧化應激會使腎臟抗氧化能力下降，引起氧化損傷，其損傷反應主要包括：蛋白氧化、脂質氧化、DNA氧化等[4]。研究已證實氧化應激是導致慢性腎功能衰竭[5]、急性腎損傷[6]、糖尿病腎病[7]等的主要致病因素之一，在各種腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，尋找可以降低機體氧化應激的有效抗氧化劑，對預防腎相關疾病的發(fā)生具有重要意義。

桑葉是國家衛(wèi)生健康委員會公布的藥食兩用植物資源。桑葉生物堿作為桑葉的一種特征活性成分，是一類以1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）為主的多羥基哌啶類化合物，具有抗氧化、降糖、降脂、保肝等作用[8]。姚佳等[9]研究表明，DNJ能顯著降低糖尿病腎病大鼠腎肥大指數(shù)、尿蛋白/肌酐比值，能較好地減輕腎損傷。還有研究證實DNJ能顯著改善腎臟脂質氧化損傷進而達到降低腎氧化應激的目的[10-11]。但目前有關桑葉總生物堿從改善蛋白、DNA氧化損傷角度全方位降低腎臟氧化應激的研究國內(nèi)外無相關報道。筆者前期研究結果表明，桑葉生物堿在體外模擬消化體系表現(xiàn)出較好的抗氧化潛力及其對生物大分子氧化損傷具有顯著的改善作用[12-13]。因此，本研究采用D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）誘導小鼠建立氧化損傷模型，通過比較評價各組小鼠腎臟脂質、DNA、蛋白質氧化損傷水平、抗氧化酶及ROS產(chǎn)生相關酶活力指標的變化，探討桑葉生物堿對氧化應激小鼠腎臟的保護作用及其機制，旨在為桑葉生物堿相關保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)，為氧化應激導致腎損傷的預防和治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明種小鼠60 只（體質量18～20 g），4 周齡，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-0003?；A飼料，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。

干燥桑葉粉，重慶市蠶業(yè)科學技術研究院提供。

桑葉生物堿，實驗室自制[14]，采用硅鎢酸沉淀法[5]測定總生物堿含量為93.57%。

D-Gal（純度≥99%）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-異前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α）、蛋白羰基（protein carbonyl，PCO）、晚期蛋白氧化產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）、8-羥基鳥嘌呤（8-hydroxy-2’-desoxyguanosine，8-OH-dG）、5-羥基胞嘧啶（5-hydroxy-2’-deoxycotosine，5-OH-dC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司；其他試劑均國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

S y m e r g y H 1 酶標儀 美國基因有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；811DK高速冷凍離心機 德國Eppendorf AG公司；KQ5200DB超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；F6/10型均漿機 上海弗魯克流體機械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)、造模及分組

小鼠按照西南大學實驗動物保護和使用規(guī)則飼養(yǎng)，室溫（23±2）℃，相對濕度40%～60%，整個實驗期間室內(nèi)通風條件良好， 1 2 h 明暗交替（9∶00 a.m.～21∶00 p.m.），所有小鼠均喂飼基礎飼料，自由覓食、飲水。

70 只雄性SPF級昆明種小鼠，飼養(yǎng)7 d適應環(huán)境后，隨機分出1 0 只小鼠為正常對照組，腹腔注射與造模試劑等體積的生理鹽水；其余小鼠腹腔注射D-Gal（1 000 mg/kgmb），連續(xù)注射20 d后，頜下采血，測定造模組、正常對照組小鼠血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SOD水平是否存在顯著性差異，若存在則判斷小鼠造模成功，用于后續(xù)實驗。

保留正常對照組小鼠10 只。剔除造模未成功的以及造模過程中死亡的10 只小鼠，剩余造模成功的50 只小鼠，隨機分為模型對照組、陽性藥物組（灌胃200 mg/kgmbGSH）以及桑葉生物堿低、中、高劑量組（分別灌胃50、100、200 mg/kgmb桑葉生物堿，劑量根據(jù)預實驗所確定），每組10 只。所有小鼠每天灌胃1 次，連續(xù)4 周。

1.3.2 腎臟樣本采集及制備

4 周實驗結束后，各實驗組小鼠禁食不禁水12 h，摘取小鼠眼球取血，然后頸椎脫臼處死，快速取出腎臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

腎臟組織按照試劑盒說明書上的方法，以質量比1∶9的比例加入生理鹽水，用均漿機均漿，3 000 r/min離心20 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 相關指標測定

腎臟中8-iso-PGF2α、PCO、AOPP、8-OH-dG、5-OH-dC的水平，抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、GSH-Px活力，NOX、PKC活力檢測，均按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 造模成功時小鼠血清中SOD、MDA水平變化

表1 D-Gal對小鼠血清中MDA、SOD水平的影響（n＝10）Table 1 Effect of D-Gal on malondialdehyde and SOD levels in serum of mice (n = 10)

由表1可知，造模成功時，與正常對照組相比，模型對照組中的MDA水平極顯著增加（P＜0.01），SOD活力極顯著降低（P＜0.01），表明小鼠造模成功。

2.2 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織蛋白氧化損傷指標的影響

蛋白的羰基化是蛋白質側鏈基團與金屬離子和H2O2反應發(fā)生的不可逆蛋白氧化修飾，PCO水平是反應細胞發(fā)生氧化損傷的重要標志[15]。AOPP是氧化應激過程中雙絡氨酸蛋白氧化產(chǎn)物，其水平與慢性腎病的發(fā)展密切相關[16]。本研究測定小鼠腎臟組中PCO、AOPP水平，以考察桑葉生物堿對腎組織蛋白氧化損傷的影響。

表2 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織PCO、AOPP水平的影響（n＝10）Table 2 Effects of mulberry leaf alkaloids on PCO and AOPP in the kidney of D-Gal-induced model mice (n= 10)

由表2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠腎組織中PCO、AOPP水平分別增加了70.66%、79.77%（P＜0.01），表明模型組小鼠腎臟發(fā)生蛋白氧化損傷；與模型組對照組相比，陽性藥物組PCO、AOPP水平分別極顯著減少了38.33%、43.75%（P＜0.01）；桑葉生物堿各劑量組可以顯著降低PCO、AOPP水平，其中高劑量組的PCO、AOPP水平分別減少了37.27%、42.71%（P＜0.01），且均恢復至正常對照組水平（P＞0.05）。結果表明，實驗劑量范圍內(nèi)，桑葉生物堿對小鼠腎臟組織中PCO、AOPP水平有明顯下調(diào)作用。

2.3 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織脂質氧化損傷指標的影響

8-iso-PGF2α是生物膜上磷脂中花生四烯酸受到ROS攻擊后發(fā)生的脂質氧化產(chǎn)物，其結構穩(wěn)定，是反應自由基脂質過氧化的理想指標[17]。本研究測定小鼠腎臟中8-iso-PGF2α水平，以考察桑葉生物堿對腎組織脂質氧化損傷的影響。

表3 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織中8-iso-PGF2α的影響（n＝10）Table 3 Effects of mulberry leaf alkaloids on 8-iso-PGF2α in the kidney of D-Gal-induced model mice (n= 10)

由表3可知，與正常對照組相比，模型組小鼠腎組織中8-iso-PGF2α質量濃度增加了140.23%（P＜0.01），表明模型組小鼠腎臟發(fā)生嚴重的脂質氧化損傷；與模型對照組相比，陽性藥物組、桑葉生物堿高劑量組的8-iso-PGF2α質量濃度分別極顯著減少了54.14%、51.07%（P＜0.01）。結果表明，實驗劑量范圍內(nèi)的桑葉生物堿對小鼠腎臟組織中8-iso-PGF2α水平有明顯的下調(diào)作用，且高劑量桑葉生物堿可使該指標恢復至與正常對照組無顯著差異的水平（P＞0.05）。

2.4 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織DNA氧化損傷指標的影響

8-OH-dG是DNA分子中鳥嘌呤第8位C原子受到ROS攻擊形成的氧化性加合物，是目前公認的評價DAN氧化損傷的指標[18]。已有研究表明5-OH-dC是另一類重要的DNA氧化損傷產(chǎn)物[19]。本研究測定小鼠腎臟組織中8-OH-dG、5-OH-dC水平的變化，以考察桑葉生物堿對腎組織DNA氧化損傷的影響。

表4 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織中8-OH-dG、5-OH-dC質量濃度的影響（n＝10）Table 4 Effects of mulberry leaf alkaloids on 8-OH-dG and 5-OH-dC in the kidney of D-Gal-induced model mice (n= 10)

由表4可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠腎組織中8-OH-dG、5-OH-dC質量濃度分別增加了51.46%、27.17%（P＜0.01），表明模型組小鼠腎臟發(fā)生DNA氧化損傷；與模型組對照組相比，陽性藥物組的8-OH-dG、5-OH-dC質量濃度分別減少33.06%、20.10%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組的8-OH-dG、5-OH-dC質量濃度分別減少了31.66%、18.91%（P＜0.01）。結果顯示，實驗劑量范圍內(nèi)，桑葉生物堿對小鼠腎臟組織中8-OH-dG、5-OH-dC質量濃度有明顯下調(diào)作用，且劑量桑葉生物堿可使這2個指標恢復至與正常對照組無顯著差異的水平（P＞0.05）。

2.5 桑葉生物堿改善D-Gal模型小鼠腎組織損傷的作用機制

2.5.1 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織SOD、GSH-Px活力的影響

SOD能有效清除機體超氧陰離子，使ROS維持在一定水平，被認為是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[20]。GSH-Px在催化還原型谷胱甘肽轉變?yōu)檠趸凸入赘孰姆矫姘l(fā)揮重要作用，且可清除機體中H2O2及脂質過氧化產(chǎn)物[21]。本研究測定小鼠腎臟組中SOD、GSH-Px活力，以考察桑葉生物堿對腎組織抗氧化能力的影響與作用途徑。

圖1 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織中SOD（a）、GSH-Px（b）活力的影響（n ＝10）Fig. 1 Effects of mulberry leaf alkaloids on the activity of SOD (a) and GSH-Px (b) in the kidney of D-Gal-induced model mice (n = 10)

由圖1可知，與正常對照組相比，模型組小鼠腎組織中SOD、GSH-Px活力分別降低了48.06%、38.52%（P＜0.01），表明模型組小鼠腎臟抗氧化能力減弱；與模型對照組相比，陽性藥物組的SOD、GSH-Px活力分別升高了87.26%、60.89%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組SOD、GSH-Px活力分別升高了83.74%、59.31%（P＜0.01）。結果顯示，實驗劑量范圍內(nèi)，桑葉生物堿能增加小鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活力，且高劑量能使這兩個指標恢復至與正常對照組無顯著差異的水平（P＞0.05）。

2.5.2 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織NOX、PKC活力的影響

NOX能將細胞內(nèi)NADPH的電子傳遞給氧分子以生成ROS，是ROS的主要來源酶[22]。PKC屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是細胞內(nèi)重要的信號轉導分子。在機體氧化應激情況下，ROS可以誘導并激活PKC，從而又促進ROS的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，導致氧化損傷不斷擴大。因此，尋找PKC特異性抑制劑對保證機體健康，特別是保護氧化應激誘導腎損傷具有重要意義[23]。

圖2 桑葉生物堿對D-Gal模型小鼠腎組織中NOX（a）、PKC（b）活力的影響（n ＝10）Fig. 2 Effects of mulberry leaf alkaloids on the activity of NOX (a) and PKC (b) in the kidney of D-Gal-induced model mice (n = 10)

由圖2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠腎組織中NOX、PKC活力分別升高了77.82%、79.96%（P＜0.01），表明模型組小鼠腎臟ROS生成量增加；與模型對照組相比，陽性藥物組NOX、PKC活力分別降低了42.77%、42.92%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組NOX、PKC活力分別降低了41.21%、40.65%（P＜0.01）。結果顯示，在實驗劑量范圍內(nèi)，桑葉生物堿能抑制小鼠腎臟組織中NOX、PKC活力，且高劑量能使這兩個指標恢復至與正常對照組無顯著差異的水平（P＞0.05）。

3 討 論

D-Gal在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，而半乳糖醇不能被細胞代謝，進而造成細胞代謝紊亂，破壞并消耗機體的抗氧化物質，進而產(chǎn)生大量的ROS[24]。脂質、蛋白質、DNA等物質是構成生命的基礎物質，而ROS高活潑且具有極強的氧化能力，能夠通過連鎖反應不斷攻擊體內(nèi)的脂質、蛋白質、DNA等物質，使它們發(fā)生氧化修飾[4]。這些化學修飾會打破機體氧化還原平衡，并且會依據(jù)損傷程度改變相應的生物學功能，最終導致病理障礙的發(fā)生和發(fā)展[25]。本研究通過注射D-Gal建立氧化應激小鼠模型，從脂質、蛋白質及DNA氧化損傷角度探究桑葉生物堿對氧化應激導致的腎功能異常的改善作用及機制。目前已有大量研究證實許多天然化合物從脂質氧化角度對腎臟氧化應激損傷具有改善作用[26-27]。馬志等[28]研究表明了桑葉總生物堿能顯著下調(diào)糖尿病腎病小鼠尿白蛋白含量及肌酐清除率，改善其腎臟組織病理損傷。本研究結果表明，200 mg/kg mb桑葉生物堿能顯著下調(diào)腎組織中PCO、AOPP、8-iso-PGF2α、8-OH-dG和5-OH-dC水平（P＜0.01），進一步從氧化應激角度證實了桑葉生物堿能有效改善腎損傷。前期研究已表明桑葉生物堿對血漿中生物大分子的氧化損傷具有明顯改善作用[12]，本研究將腎臟組織中評價蛋白質、脂質、DNA氧化損傷與血漿中指標作相關性分析，血漿與腎臟組織中PCO、AOPP、8-iso-PGF2α、8-OH-dG、5-OH-dC水平之間的相關系數(shù)分別為0.912、0.972、0.986、0.975、0.911（P＜0.01）。表明血漿與腎臟組織氧化應激損傷具有極顯著相關性，則可考慮檢測血漿中氧化損傷指標來反應腎臟氧化損傷情況，不必進行腎臟組織的活體檢測，有利于活體動物的保存。

機體內(nèi)的抗氧化還原酶系統(tǒng)能降低ROS的生成及其導致的損害作用，從而維持細胞的正常功能和氧化還原平衡。這些抗氧化酶能直接參與ROS的清除并通過結合ROS生產(chǎn)時所需要的金屬離子來抑制ROS的產(chǎn)生。內(nèi)源性抗氧化酶如SOD、GSH-Px等，是生物體中抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，在保護細胞免受氧化損傷的過程中起著重要作用[29]。本研究結果表明，模型組小鼠SOD、GSH-Px的活力明顯受抑制，給予桑葉生物堿后，腎組織內(nèi)抗氧化酶活力有升高趨勢，且高劑量組能使這兩種酶活力恢復到與正常組無顯著性差異（P＞0.05）的水平，說明桑葉生物堿能通過上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶的活力來緩解腎臟氧化損傷。

NOX被認為是機體氧化還原信號的關鍵酶，可通過NADPH依賴的單電子還原系統(tǒng)將機體氧分子還原成超氧負離子，通過質膜傳遞電子而生成化學性質活潑、含氧功能基團的化合物ROS[30-31]。已有研究表明，使用NOX抑制劑或敲除NOX的基因，能明顯減輕氧化損傷[32]。因此，抑制NOX活性是預防機體ROS過量產(chǎn)生的有效途徑之一。正常腎組織中，N末端作為假底物與C末端催化區(qū)的底物結合位點相結合，使PKC以無活性的形式存在于胞漿內(nèi)，當受到外源性刺激時，在特異性底物蛋白的作用下向包膜轉移而被活化，進而催化NADPH發(fā)生氧化反應，產(chǎn)生H2O2[33-34]。已有研究證實了生物堿化合物可抑制NOX、PKC的活性[35]。本研究結果表明，200 mg/kg mb桑葉生物堿能顯著抑制NOX、PKC活性（P＜0.01），表明桑葉生物堿能作為NOX、PKC的有效抑制劑進而控制機體ROS大量生成。

綜上所述，桑葉生物堿能有效改善氧化應激導致的腎損傷，其機制可能與升高抗氧化酶和抑制NOX、PKC活力，進而減少機體ROS過量產(chǎn)生有關。該研究結果有助于氧化應激誘導的腎損傷的預防和治療，有助于桑葉生物堿的綜合開發(fā)利用。