石 磊， 周偉東， 馬駿杰， 李 超， 吳登龍

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上海 200065)

尿道缺損、尿道下裂是泌尿外科常見的臨床疾病,嚴(yán)重影響患者排尿功能和生活質(zhì)量。復(fù)雜性尿道缺損的治療更是泌尿外科醫(yī)生面對的棘手難題[1-3]。尿道修復(fù)重建術(shù)是治愈尿道缺損疾病的有效方法，尿道修復(fù)術(shù)所需大面積的正常組織，可從患者自體如舌黏膜、外生殖器皮膚[4-9]等部位取材獲得，但不可避免會在這些部位引發(fā)出血、炎癥、感染、疼痛等。尤其對于長段尿道狹窄和多次手術(shù)失敗后的患者，供體組織的有限性以及相關(guān)取材創(chuàng)傷極大地增加了治療的難度和并發(fā)癥的發(fā)生。隨著干細(xì)胞和組織工程技術(shù)的快速發(fā)展[10-13]，自體干細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用已經(jīng)成為臨床研究熱點(diǎn)。研究表明脂肪干細(xì)胞具有向尿路上皮細(xì)胞分化的能力，可作為尿道組織工程重建的種子細(xì)胞[14]。為此，本實(shí)驗(yàn)采用兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)向上皮細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞雙向誘導(dǎo)構(gòu)建復(fù)合細(xì)胞膜片進(jìn)行尿道修復(fù)重建的實(shí)驗(yàn)探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2～3月齡體新西蘭兔18只，體重2.5～3kg，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，用于ADSCs提取和兔尿道損傷模型構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑材料 CD34、CD45、CD29、CD44干細(xì)胞流式抗體試劑盒購自Cyagen公司；Phosphate-Buffered Saline(1×PBS)、兔ADSCs完全培養(yǎng)基購自Cyagen公司；Lentivirus-GFP病毒液購自CyPeogen公司；D-Hanks溶液、0.1%Ⅰ型膠原酶購自Sigma公司；離心機(jī)、氣浴振蕩器、流式細(xì)胞儀購自Thermo公司；864合劑(速麻安)、DMFM/F1 2培養(yǎng)基購自Gibco公司；UpCell表面培養(yǎng)皿、8F醫(yī)用硅膠管、上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(epithelial cell medium)購自ScienCell公司；平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(SMCM)購自ScienCell公司；胎牛血清(FBS)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、0.25%trypsin-0.04%EDTA購自上海元象生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c分組 實(shí)驗(yàn)分組分為2組。(1) ADSCs 誘導(dǎo)復(fù)合膜片組： 9只新西蘭兔用ADSCs誘導(dǎo)上皮/平滑肌細(xì)胞復(fù)合膜片仿生材料行兔尿道修復(fù)重建術(shù)；(2) 單純無細(xì)胞SIS對照組： 9只新西蘭兔，用無細(xì)胞SIS膜片材料行兔尿道修復(fù)重建術(shù)(SIS： 小腸黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì))。

1.2.2 ADSCs體外提取培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定 取雄性新西蘭大白兔以0.1～0.15mL/kg劑量注射入耳緣靜脈麻醉后在無菌情況下取新西蘭兔(體重2.5kg左右)腹股溝皮下脂肪組織，將吸脂來源的脂肪組織用D-Hanks沖洗，清除外包膜、明顯的結(jié)締組織和可見的小血管。去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積。向組織中加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，放入37℃ 氣浴振蕩器中消化30min。當(dāng)消化完成后，棄掉上層未消化的脂肪組織，將下層的細(xì)胞懸液以離心10min(離心半徑18cm，1500r/min)后棄上清液，得到離心管底部的脂肪干細(xì)胞團(tuán)，將其重懸，密度調(diào)整到1×105/mL，然后接種在培養(yǎng)面積為25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d后觀察并換液并除去未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，在細(xì)胞長到80%～85%底面積時先用PBS沖洗1次，再行0.25%胰酶消化并靜止5min 后，加入適量10%胎牛血清終止消化反應(yīng)，用吸管輕輕吹打均勻后轉(zhuǎn)入離心管中離心5min(離心半徑18cm，1000r/min)，棄上清液，按1∶3比例傳代。

1.2.3 ADSCs向上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)和胞膜片培養(yǎng)與鑒定 取P3或P4代ADSCs接種至6孔板，用ADSCs專用培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)、換液，當(dāng)ADSCs細(xì)胞密度在50%時更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。向上皮細(xì)胞方向誘導(dǎo)；當(dāng)ADSCs密度到50%時更換成2mL EPiCM-2培養(yǎng)基，添加5μmol/L的ATRA，20ng/mL EGF，每天換液,連續(xù)誘導(dǎo)14d培養(yǎng)并鑒定；向平滑肌細(xì)胞方向誘導(dǎo)；當(dāng)ADSCs細(xì)胞密度到達(dá)50%時更換為平滑肌生長培養(yǎng)基，加入含有20ng/mL PDGF-BB進(jìn)行生長因子誘導(dǎo)條件下常規(guī)培養(yǎng)。此后每3d換液1次并保證培養(yǎng)瓶內(nèi)PDGF-BB濃度不變，繼續(xù)37℃，中間隔天換1次誘導(dǎo)液不傳代，14d后換成含有SmGM-2 SingleQuots的平滑肌生長培養(yǎng)基(SmBM)中培養(yǎng)并鑒定。將ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)后所獲的上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞移入各自的6孔溫敏型培養(yǎng)皿(Upcell)，每孔加入2mL 37℃預(yù)熱的專業(yè)完全細(xì)胞培養(yǎng)基后置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔2d換液1次。只換液不傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合超過100%時，于20℃放置30min，當(dāng)細(xì)胞膜邊緣翹起時吸走培養(yǎng)液，覆蓋上配帶的轉(zhuǎn)移膜，用無菌鑷子輕輕夾起轉(zhuǎn)移膜，將細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移新的6孔板中，加入培養(yǎng)基至完全浸過細(xì)胞片，20℃放置 30min 后夾起轉(zhuǎn)移膜將另外溫敏孔中細(xì)胞膜片覆蓋，重復(fù)之前操作，將4張上皮細(xì)胞片相互疊加，置37℃孵育1h，加入上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；將所獲3張平滑肌細(xì)胞片相互疊加后置37℃孵育1h，加入平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 雙細(xì)胞復(fù)合膜片綠色熒光蛋白示蹤 將有上皮細(xì)胞膜片和平滑肌細(xì)胞膜片的12孔板，培養(yǎng)基減半并確保液面浸沒膜片，加入滴度1×108TU/mL表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的慢病毒液20μL，37℃培養(yǎng)12h后更換成含有10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，熒光鏡下觀察細(xì)胞侵染細(xì)胞膜片效果。

1.2.5 雙細(xì)胞復(fù)合膜片仿生尿道的構(gòu)建 按照尿道組織上皮層-肌層排列順序結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，由內(nèi)向外按照上皮細(xì)胞膜片-平滑肌細(xì)胞膜片，以8F醫(yī)用硅膠管作為內(nèi)核支撐包被復(fù)合而成長度約2.0cm，直徑4mm的細(xì)胞膜片仿生尿道，按照順時針輕輕卷滾膜片并且使細(xì)胞膜片的完整性，由于細(xì)胞膜片含有豐富ECM可促進(jìn)膜片間很好地粘合成整體。同時將無細(xì)胞SIS包裹8F醫(yī)用硅膠管，用4-0可吸收縫線固定后作為對照組材料一并移植自體兔腹股溝皮下，以促進(jìn)細(xì)胞膜片仿生尿道組織生物力學(xué)機(jī)械強(qiáng)度和血管生成。3周后取出細(xì)胞膜片組和對照組，分別移去中間醫(yī)用硅膠管待用。

1.2.6 體內(nèi)兔損傷尿道修復(fù)重建 應(yīng)用體外構(gòu)建的雙細(xì)胞膜片組織工程仿生尿道重建兔長段2cm全層環(huán)形尿道缺損。將3%戊巴比妥(1mL/kg)注入雄性新西蘭兔耳靜脈至全麻，按照常規(guī)無菌手術(shù)操作行下腹部及會陰部備皮、消毒、鋪巾，將8F醫(yī)用導(dǎo)尿管置入兔尿道內(nèi)，在距尿道外口2.0cm起沿尿道腹側(cè)正中切口，構(gòu)建切除與替代長度均為2cm全層環(huán)形尿道缺損模型，將制備好的雙細(xì)胞膜片仿生尿道移植物入實(shí)驗(yàn)組模型，無細(xì)胞SIS膜片材料入對照組模型，行尿道端端吻合術(shù)與自體端尿道吻合，用6-0縫線逐一縫合關(guān)閉切口，固定導(dǎo)尿管，肌內(nèi)注射氧氟沙星5mg/(kg·d)防感染，14d后移去8F導(dǎo)尿管，每組分別在術(shù)后1，6個月各取3只處死，尿道造影觀察尿道管腔通暢情況和剖開尿道替代處進(jìn)行大體觀察。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs形態(tài)及表面特征

ADSCs鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為梭形，少數(shù)呈三角形或多角形，螺旋形生長，細(xì)胞活性良好；低代數(shù)時培養(yǎng)可看到一些光澤性強(qiáng)的小圓細(xì)胞,隨代數(shù)增加后消失；ADSCs增殖力很強(qiáng)，第12代細(xì)胞仍未見衰老現(xiàn)象。細(xì)胞表面CD29表達(dá)陽性率為93.37%，CD44表達(dá)陽性率為87.33%，不表達(dá)CD34，CD45(圖1)。

2.2 ADSCs向上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)、GFP示蹤及膜片染色鑒定結(jié)果

ADSCs在向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程逐漸呈現(xiàn)典型的“鋪路石”狀，細(xì)胞大小均一(圖2A、圖2B)；在向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的ADSCs呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞形態(tài)(圖2C、圖2D)；上皮細(xì)胞膜片表面光滑，質(zhì)地均勻，膜片厚度較?。籋-E染色顯示上皮細(xì)胞膜片大約25μm，2～3層細(xì)胞厚度，細(xì)胞膜片與細(xì)胞呈典型的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，且ECM豐富(圖2E)；ADSCs成肌細(xì)胞膜片顯示緊密的細(xì)胞連接呈條狀排列，融合成肌管樣纖維，成肌細(xì)胞膜片免疫組化顯示desmin、α-SMA在細(xì)胞片上呈陽性染色；H-E染色顯示成肌細(xì)胞膜片厚度70μm(圖2E)；慢病毒感染細(xì)胞膜片GFP表達(dá)明顯(圖2F)。

圖1 兔ADSCs細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Primary culture and identification of ADSCsA： P1代兔ADSCs細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形，融合度為80%～90%；B： FACS檢測CD29表達(dá)；C： FACS檢測CD44表達(dá)

圖2 細(xì)胞形態(tài)與組織染色Fig.2 Cell morphology and tissue stainingA、B： ADSCs誘導(dǎo)上皮細(xì)胞(×100)；C、D： ADSCs誘導(dǎo)平滑肌皮細(xì)胞(×100)；E： 上皮細(xì)胞膜片和平滑肌細(xì)胞膜片H-E染色(×100)；F： Lentivirus-GFP 感染細(xì)胞膜片GFP表達(dá)效果(×200)

2.3 大體觀察

對實(shí)驗(yàn)中所有新西蘭兔行尿道修復(fù)吻合術(shù)，術(shù)后消炎處理，所有實(shí)驗(yàn)動物術(shù)后均未出現(xiàn)死亡，手術(shù)后未發(fā)生感染。實(shí)驗(yàn)組中的9例術(shù)后未出現(xiàn)尿道狹窄，對照組的9例中術(shù)后有3例出現(xiàn)了尿道狹窄。實(shí)驗(yàn)組和對照組均出現(xiàn)兩例尿瘺，可能與實(shí)驗(yàn)動物術(shù)后因切口疼痛及留置尿管不適，自行撕咬，造成尿管過早脫落(1周內(nèi))有關(guān)。

術(shù)后1個月進(jìn)行兩組模型尿道修復(fù)段大體觀察；ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組尿道修復(fù)段光滑平整，未見明顯瘢痕及炎性反應(yīng)(圖3A)；單純無細(xì)胞SIS對照組尿道修復(fù)段可見瘢痕疙瘩形成(圖3B)，并有明顯的炎性反應(yīng)形成(圖3C)。

圖3 ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組及單純無細(xì)胞SIS對照組修復(fù)尿道大體觀察Fig.3 General observation on the repair of urethra by ADSCs induced composite membrane group and the cell-free SIS control groupA： 術(shù)后1個月，ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組修復(fù)段(藍(lán)色箭頭之間)光滑平整，未見明顯瘢痕及炎性反應(yīng);B： 術(shù)后1個月，單純無細(xì)胞SIS對照組,藍(lán)色箭頭之間可見瘢痕疙瘩形成,紅色箭頭指向位置；C： 術(shù)后1個月，單純無細(xì)胞SIS對照組有明顯的炎性反應(yīng)

分別于術(shù)后1個月及6個月進(jìn)行尿道造影，結(jié)果顯示： 以ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組修復(fù)段的尿道重建，尿道管腔可保持通暢，修復(fù)段尿道黏膜平整(圖4A)，與正常尿道黏膜界限不清，尿道造影未見明顯狹窄表現(xiàn)。而單純無細(xì)胞SIS對照組，可發(fā)現(xiàn)形成不同程度的尿道管腔狹窄，修復(fù)段尿道存在明顯的瘢痕增生和攣縮，尿道造影顯示修復(fù)段尿道存在尿道狹窄(圖4B)。

2.4 組織學(xué)觀察

對所取修復(fù)段尿道行H-E染色，以ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組構(gòu)建的組織工程仿生尿道修復(fù)尿道缺損，術(shù)后1個月上皮細(xì)胞排列整齊，形成多層且連續(xù)性好(圖5A)，術(shù)后6個月后雙標(biāo)免疫熒光染色，觀察可發(fā)現(xiàn)ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組修復(fù)段已形成穩(wěn)定的上皮細(xì)胞層多層組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞層下可見明顯的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成(圖5C、圖5E)。單純無細(xì)胞SIS對照組修復(fù)尿道新生黏膜尚不連續(xù)且邊界不完整，在術(shù)后6個月觀察發(fā)現(xiàn)仍未形成連續(xù)的上皮細(xì)胞層次(圖5B、圖5D)。

圖5 實(shí)驗(yàn)組和對照組術(shù)后尿道組織學(xué)形態(tài)結(jié)果Fig.5 Postoperative urethral histology results of study group and control groupA為ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片替代尿道H-E染色檢測評價修復(fù)段與正常尿路上皮連續(xù)性良好；C為免疫熒光檢測評價各修復(fù)尿段上皮組織學(xué)改變，ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片替代尿道上皮層細(xì)胞長成情況(AE1/AE3： 尿道上皮細(xì)胞表型，藍(lán)色為DAPI染細(xì)胞核)；E為免疫熒光檢測評價ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片替代尿道平滑肌生長情況良好，層次明顯增多、增厚(α-SMA： 尿道平滑肌細(xì)胞表型，藍(lán)色為DAPI染細(xì)胞核)；B、D、F為對照組

3 討 論

尿道修復(fù)所用得尿道替代材料大多以自體組織為主，脂肪干細(xì)胞在人體分布廣泛，易獲取、增殖能力強(qiáng)，體外培養(yǎng)可誘導(dǎo)分化和無倫理限制[15]，是理想的臨床尿道修復(fù)重建組織工程材料。已有研究報(bào)道將ADSCs注入尿道壁內(nèi)8周后尿道各層及平滑肌層均發(fā)現(xiàn)具有熒光標(biāo)記的ADSCs，說明ADSCs已融合于尿道組織之中[16]。隨后，ADSCs和材料復(fù)合構(gòu)建支架進(jìn)行尿道缺損修復(fù)研究逐漸進(jìn)入研究熱點(diǎn)方向。以ADSCs作為種子細(xì)胞再復(fù)合基質(zhì)材料以及ECM材料修復(fù)兔尿道缺損修復(fù)[17-18]。但上述方法僅并不適用于長段(2cm)管化尿道缺損的修復(fù)重構(gòu)，Atala等[19]報(bào)道長度在1cm之內(nèi)的管狀化尿道修復(fù)多采用ECM材料，原因可能是機(jī)體滋養(yǎng)血管無法延伸入長段缺損中心部位，導(dǎo)致復(fù)合材料內(nèi)部細(xì)胞缺血導(dǎo)致潛行能力減弱，時間長久引起機(jī)體炎癥和尿瘺等并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)擬探索應(yīng)用ADSCs雙向誘導(dǎo)成上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞復(fù)合膜片進(jìn)行尿道缺損重構(gòu)的可行性。

本實(shí)驗(yàn)成功獲取兔ADSCs，細(xì)胞增殖力強(qiáng)，貼壁性良好，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得大量純度較高的ADSCs。本實(shí)驗(yàn)通過在培養(yǎng)基中加入EGF誘導(dǎo)因子對ADSCs進(jìn)行3周的促向上皮細(xì)胞分化并培養(yǎng)成上皮細(xì)胞膜片，在20ng/mL PDGF-BB生長因子誘導(dǎo)下，ADSCs成功向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)并培養(yǎng)成平滑肌細(xì)胞膜片，H-E染色發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后細(xì)胞與細(xì)胞呈典型的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，且ECM豐富。兩種細(xì)胞膜片疊加復(fù)合包裹在8F硅膠管構(gòu)建尿道生理結(jié)構(gòu)的仿生尿道，仿生尿道保持良好的圓柱狀外觀，表面光滑，大體觀察發(fā)現(xiàn)，單純無細(xì)胞SIS對照組尿道修復(fù)段可見瘢痕疙瘩形成，而ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片實(shí)驗(yàn)組尿道修復(fù)段光滑平整，未見明顯瘢痕及炎性反應(yīng)；術(shù)后6個月后取修復(fù)部組織雙標(biāo)免疫熒光染色，觀察可發(fā)現(xiàn)ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組修復(fù)段已形成穩(wěn)定的上皮細(xì)胞層多層組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞層下可見明顯的平滑肌層及毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成。尿道造影觀察可見以ADSCs誘導(dǎo)復(fù)合膜片組尿道管腔可保持通暢，尿道黏膜平整并與正常尿道黏膜界限不清，未見明顯狹窄表現(xiàn)，單純無細(xì)胞SIS對照組可見不同程度的尿道管腔狹窄，明顯的瘢痕增生和攣縮。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ADSCs分別向上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，避免了常規(guī)組織工程重建技術(shù)中的應(yīng)用多種種子細(xì)胞時，需要分別從不同來源獲得種子細(xì)胞，從而造成多處取材部位的創(chuàng)傷可能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，細(xì)胞膜片在回植入體內(nèi)后，可在修復(fù)部位存活并增殖。細(xì)胞膜片的優(yōu)勢在于既去除了支架材料降解的影響，又保留了細(xì)胞之間的密切聯(lián)系，并且細(xì)胞連接之間存在正常的細(xì)胞間質(zhì)組織，更有利保持細(xì)胞的活性，可促近細(xì)胞在修復(fù)部位的生長和增殖。而單純無細(xì)胞SIS對照組，在回植體內(nèi)后，因表面缺乏種子細(xì)胞，修復(fù)段需完全靠周圍自體組織細(xì)胞增生、遷移，而狹窄段過長，故無法完成正常的修復(fù)，從而造成修復(fù)段瘢痕形成，再狹窄的發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)組和對照組均出現(xiàn)2例尿瘺，與實(shí)驗(yàn)動物術(shù)后因切口疼痛及留置尿管不適，自行撕咬，造成尿管過早脫落(1周內(nèi))有關(guān)[20]。

本研究應(yīng)用脂肪干細(xì)胞雙分化技術(shù)，聯(lián)合細(xì)胞膜片技術(shù)，體外成功構(gòu)建最接近尿道生理結(jié)構(gòu)的組織工程尿道，尿道重建效果良好，為組織工程尿道重建提供了新的思路，并為該技術(shù)在尿道重建的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。