古麗娜兒， 王思橦， 黃莉莉， 劉竹青， 朱忠政， 許 青

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200072； 2. 上海市皮膚病醫(yī)院腫瘤科，上海 200443； 3. 同濟(jì)大學(xué)癌癥中心，上海 200072)

結(jié)腸癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，有著很高的發(fā)病率和死亡率[1]。結(jié)腸癌的治療除了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療及靶向治療等之外，最近免疫治療也成為一個(gè)熱點(diǎn)[2-3]。溶瘤病毒(oncolytic virus, OVs)療法是一種直接作用于腫瘤細(xì)胞的治療方法。經(jīng)遺傳修飾的病毒或天然存在的病毒感染腫瘤細(xì)胞，選擇性在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解與死亡。由于溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制，并不需要整合到宿主基因中，因此它們作為溶瘤劑安全、有效[4-6]。

新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)屬溶瘤病毒的一種，臨床前和臨床研究顯示NDV病毒株具有殺死多種來源的癌細(xì)胞的潛力[7]。既往研究證明，NDV/FMW毒株在體外特異性殺傷人肝癌細(xì)胞株SMMC7721、肺癌細(xì)胞株A549，同時(shí)對正常人胚胎肝細(xì)胞L-O2、對正常人胚腎細(xì)胞HEK293等殺傷率不到1%[8]。NDV/FMW在肺癌[9]、甲狀腺癌[10]、黑色素瘤[11]、前列腺癌[12]等多種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑與細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡有關(guān)[13]。MAPK信號通路有3個(gè)亞家族，分別為MAPK(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，ERK)、p38亞家族和JNK。既往研究表明，p38MAPK通路在NDV/FMW誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中起重要作用[10]。本研究旨在細(xì)胞水平上驗(yàn)證NDV/FMW對結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞株來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫(上海)；雞胚成纖維DF-1細(xì)胞株購自美國ATCC公司；新城疫病毒NDV/FMW毒株(GenBank登記編號： GU564399)由大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究院孟松樹實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶(Trypsin-EDTA)、胎牛血清(FBS)、雙抗(Pen Strep)、表皮生長因子(EGF)、b27均購自Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自德國默克公司；抗體： 血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)(鼠)購自Santa Cruz公司；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinylaspartate specific protease, Caspase3)、兔抗人poly ADP-ribose polymerase(PARP)、兔抗人p38、兔抗人磷酸化p38(p-p38)、兔抗人JNK、兔抗人p-JNK均購自CST公司；兔抗人Erk1/2、兔抗人p-Erk1/2、泛胱天蛋白酶肽抑制劑Z-VAD-FMK購自Promega公司；多克隆β-actin(鼠)購自Sigma-Aldrich公司；羊抗兔二抗購自Proteintech公司；羊抗鼠二抗購自Bioworld公司；p38MAPK抑制劑SB203580購自Calbiochem公司；JNK MAPK抑制劑SP600125購自Selleck公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自Med Chem Express公司；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(Hoechst 33258染色液)購自碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞株、DF-1細(xì)胞株均用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中按照常規(guī)方法培養(yǎng)。

1.3 病毒滴度測定

取對數(shù)生長的Caco2細(xì)胞，胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪板，用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection， MOI)為0.01的NDV/FMW感染Caco2細(xì)胞株，分別于24、48、72h時(shí)收集上清液，-80℃反復(fù)凍融3次后進(jìn)行梯度稀釋，用病毒液感染DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測定，病毒感染第2天起觀察細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)培養(yǎng)7d，統(tǒng)計(jì)每列病變孔直至不再出現(xiàn)病變孔，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。

1.4 CCK8檢測細(xì)胞存活率

將Caco2細(xì)胞接種到96孔板，分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各實(shí)驗(yàn)組分別用MOI為0.001、0.01、0.1、1、2、3、5、10的NDV/FMW感染細(xì)胞1h后，更換1% DMEM培養(yǎng)基，將96孔板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48h，待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后向待測孔加入10μL/孔的CCK8溶液，將細(xì)胞培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度(A450)，并計(jì)算分析。

1.5 細(xì)胞成球培養(yǎng)

成球培養(yǎng)液配置： 無血清DMEM/F12(50mL)+20ng/mL bFGF+20ng/mL EGF+b27(1∶50)。

2D細(xì)胞消化后，完全培養(yǎng)液重懸，離心5min(室溫，離心半徑13.5cm， 1000r/min)，去上清液；DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，再次離心5min(室溫，離心半徑13.5cm， 1000r/min)，去上清液；成球培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，1000/孔鋪于96孔低黏附板內(nèi)，置于37℃、5%CO2下連續(xù)培養(yǎng)7d，待細(xì)胞成球。

1.6 Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

種植Caco2細(xì)胞于6孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后用MOI為1的NDV/FMW感染細(xì)胞48h；取出細(xì)胞加入500μL/孔固定液固定10min、磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍；再加入500μL/孔Hoechst 33258染色液染色5min、PBS清洗3遍；最后滴一滴抗熒光猝滅封片液在載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片、避光、倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。

1.7 Western印跡法

Caco2細(xì)胞株100萬/皿接種在60mm細(xì)胞皿內(nèi)，分別設(shè)空白對照組與NDV/FMW感染實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組用MOI為1的NDV/FMW感染1h后，更換1% DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。NDV/FMW感染12、24、48h后收集細(xì)胞裂解液，考馬斯亮藍(lán)法測定裂解液中的蛋白濃度。取20μg蛋白用10%的分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，4% BSA常溫封閉2h，孵育一抗兔抗人Caspase3抗體4℃過夜，TBST洗膜后常溫孵育二抗2h，TBST洗膜、顯色、用凝膠成像儀顯影，觀察Caspase3蛋白及其磷酸化裂解片段cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)情況。其他蛋白表達(dá)水平檢測方法同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 NDV/FMW在結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

用MOI為0.01的NDV/FMW感染Caco2細(xì)胞24、48、72h后，病毒滴度隨時(shí)間增加逐漸增加(圖1A)。MOI為1的NDV/FMW病毒感染細(xì)胞24、48、72h后，Western印跡法檢測HN蛋白(NDV/FMW的基因組蛋白之一)表達(dá)水平隨時(shí)間增加而增加(圖1B)，提示NDV/FMW在Caco2細(xì)胞株中可以有效復(fù)制。

圖1 NDV/FMW在Caco2細(xì)胞株中有效復(fù)制Fig.1 NDV/FMW effectively replicated in Caco2 cellsA： 病毒滴度法檢測NDV/FMW在Caco2細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，MOI=0.01；B： Western印跡法檢測NDV/FMW病毒蛋白HN表達(dá)情況,β-actin為內(nèi)參蛋白

2.2 NDV/FMW降低Caco2細(xì)胞的存活率

NDV/FMW感染2D培養(yǎng)Caco2細(xì)胞24、48h后，CCK8檢測結(jié)果顯示隨著MOI值升高和感染時(shí)間增加細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.001)，見圖2A。在體外環(huán)境中，細(xì)胞成球被認(rèn)為時(shí)模擬腫瘤體內(nèi)生物學(xué)特性的有效模型。1個(gè)MOI值的NDV/FMW感染3D培養(yǎng)Caco2細(xì)胞24、48h后，與對照組相比NDV/FMW感染細(xì)胞不能二次成球，顯著降低3D培養(yǎng)Caco2細(xì)胞的存活率(圖2B)。

圖2 NDV/FMW降低Caco2細(xì)胞株的存活率Fig.2 NDV/FMW reduced cell viability of Caco2 cellsA： NDV/FMW感染2D培養(yǎng)Caco2細(xì)胞24、48h后，CCK8法檢測細(xì)胞存活率逐漸降低，***P<0.001，****P<0.0001；B： 經(jīng)NDV/FMW感染3D培養(yǎng)的Caco2細(xì)胞24、48h后，病毒感染組細(xì)胞不能二次成球

2.3 NDV/FMW誘導(dǎo)Caco2細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴性凋亡

經(jīng)Hochest33258染色采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，病毒感染組較空白對照組細(xì)胞綠色熒光明顯增加細(xì)胞呈凋亡形態(tài)學(xué)改變(圖3A)。用MOI=1的NDV/FMW感染Caco2細(xì)胞12、24、48h后(分別設(shè)置空白對照組)，Western印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白變化。Western印跡法檢測結(jié)果顯示在病毒感染細(xì)胞后48h時(shí)，裂解的Caspase3(cleaved-Caspase3)和裂解的PARP(cleaved-PARP)蛋白表達(dá)水平明顯增加(圖3B)。采用泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞后，再用NDV/FMW(MOI=1)感染細(xì)胞48h，與僅感染病毒組相比，Z-VAD-FMK降低了病毒感染細(xì)胞中cleaved-Caspase3和cleaved-PARP表達(dá)水平(圖3C)，結(jié)果表明NDV/FMW誘導(dǎo)Caco2細(xì)胞凋亡，并且NDV/FMW誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡依賴于Caspase。

圖3 NDV/FMW誘導(dǎo)Caco2細(xì)胞凋亡Fig.3 NDV/FMW induced apoptosis in Caco2 cellsA： Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下(×200)觀察NDV/FMW(MOI=1,48h)處理Caco2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;B： Western印跡法檢測細(xì)胞裂解的Caspase和PARP條，β-actin作為內(nèi)參;C： Z-VAD-FMK(25μM)預(yù)處理Caco2細(xì)胞，Western印跡法檢測裂解的Caspase和PARP蛋白，β-actin作為內(nèi)參

2.4 NDV/FMW調(diào)控p38MAPK信號通路

為了進(jìn)一步探究NDV/FMW誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，檢測了MAPK下游信號通路蛋白p38、Erk1/2、JNK的活化。經(jīng)NDV/FMW病毒感染Caco2細(xì)胞12、24、48h后，Western印跡法檢測結(jié)果顯示，NDV/FMW感染后p38MAPK通路明顯活化；病毒感染24、48h后磷酸化的JNK蛋白水平亦增加；然而，Erk1/2沒有明顯變化(圖4A)。

NDV/FMW可能通過促進(jìn)p38MAPK和JNK MAPK信號通路的活化而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步為了明確p38MAPK和JNK MAPK信號通路在NDV/FMW誘導(dǎo)結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞凋亡中的作用，利用p38MAPK特異性抑制劑SB203580和JNK MAKP抑制劑SP60015預(yù)處理細(xì)胞30min后，NDV/FMW感染細(xì)胞48h，檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。Western印跡法檢測結(jié)果顯示，SB203580預(yù)處理組凋亡蛋白Caspase3及PARP裂解片段表達(dá)水平較僅NDV/FMW感染組顯著減少，與對照組相比，p38MAPK抑制劑SB203580處理組明顯減少了NDV/FMW引起的細(xì)胞凋亡；SP60015預(yù)處理后凋亡蛋白Caspase3和PARP裂解片段增加與NDV/FMW感染組沒有明顯變化(圖4B)。提示p38MAPK參與NDV/FMW誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，而不是JNK MAPK通路。

圖4 NDV/FMW調(diào)控p38MAPK信號通路Fig.4 NDV/FMW regulated p38MAPK signaling pathwayA： NDV/FMW(MOI=1)感染Caco2細(xì)胞12、24、48h后，Western印跡法檢測p38、JNK、Erk1/2及磷酸化p38、JNK、Erk1/2 蛋白水平，β-actin作為內(nèi)參;B： SB203580和SP600125預(yù)處理30min后，NDV/FMW(MOI=1)感染Caco2細(xì)胞48h，Western印跡法檢測PARP、Caspase3蛋白水平，β-actin作為內(nèi)參

3 討 論

目前已開展多項(xiàng)基于溶瘤病毒NDV治療腫瘤的臨床試驗(yàn)。實(shí)際上，根據(jù)統(tǒng)計(jì)2017年已有78項(xiàng)溶瘤病毒應(yīng)用相關(guān)臨床試驗(yàn)已被注冊，癌種包括多種實(shí)體瘤。但在結(jié)腸癌中的研究多數(shù)停留在Ⅰ/Ⅱ期臨床研究[14-15]，雖然有Ⅲ期的臨床試驗(yàn)研究報(bào)道了NDV的抗腫瘤作用，這些報(bào)道多是關(guān)于NDV對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移瘤的抗腫瘤作用，或者NDV作為佐劑的作用[16-17]。前期研究已證明新城疫病毒FMW毒株NDV/FMW在肺癌[9]、甲狀腺癌[10]、黑色素瘤[11]、前列腺癌[12]等多種腫瘤細(xì)胞中的直接溶瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，NDV/FMW感染2D培養(yǎng)Caco2細(xì)胞24、48h后，隨著MOI值升高和感染時(shí)間增加細(xì)胞存活率逐漸降低。實(shí)驗(yàn)用MOI=1的NDV/FMW感染Caco2細(xì)胞48h后，經(jīng)Hoechst33258熒光染色檢測，病毒感染后Caco2細(xì)胞株綠色熒光明顯增加，NDV/FMW可能促進(jìn)其發(fā)生凋亡。為了明確NDV/FMW是否誘導(dǎo)結(jié)腸癌上述細(xì)胞株凋亡，本研究采用Western印跡法檢測NDV/FMW感染后Caco2細(xì)胞中凋亡相關(guān)Caspase3、cleaved-Caspase3和PARP、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MOI=1的NDV/FMW感染48h條件下，Caco2細(xì)胞株NDV/FMW感染組Caspase3、PARP蛋白表達(dá)水平顯著降低，cleaved-Caspase3、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示NDV/FMW誘導(dǎo)Caco2細(xì)胞株凋亡。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells， CSCs)通過自我更新和分化能力維持著腫瘤的無限增殖，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移[18]。研究發(fā)現(xiàn)，CSCs對化療或放療具有原發(fā)耐藥性[19-20]。CSCs在體外形成多細(xì)胞3D球，可在無血清培養(yǎng)條件下成長[21]。在體外環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞成球被認(rèn)為是模擬腫瘤體內(nèi)生物學(xué)特性的有效模型。本研究通過體外3D培養(yǎng)Caco2細(xì)胞株，在MOI=1的NDV/FMW感染細(xì)胞球24、48h條件下，NDV/FMW抑制結(jié)腸癌細(xì)胞球二次成球能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，NDV/FMW在體外對3D培養(yǎng)Caco2細(xì)胞株具有潛在溶瘤能力。

NDV的溶瘤機(jī)制包括多種途徑，其中一個(gè)途徑就是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡引起溶瘤作用，NDV通過內(nèi)在線粒體途徑和外在死亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這兩種途徑都會轉(zhuǎn)化為Caspase的級聯(lián)激活[22]。本實(shí)驗(yàn)采用泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞后，與僅感染病毒組相比，Z-VAD-FMK降低了病毒感染細(xì)胞中cleaved-Caspase3和cleaved-PARP表達(dá)水平，提示NDV/FMW誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡依賴于Caspase。

p38MAPK信號通路的活化有賴于蘇氨酸和酪氨酸雙位點(diǎn)的同時(shí)磷酸化，正常情況下ATP提供磷酸化所需的磷酸基團(tuán)，而p38MAPK抑制劑SB203580與ATP競爭作用于p38 ATP結(jié)合活性位點(diǎn)Thr106，使p38不能與ATP結(jié)合，從而失去激酶活性[23-24]。既往研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK通路在NDV/FMW誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡中起重要作用[25]。在實(shí)驗(yàn)中，NDV/FMW感染細(xì)胞中磷酸化p38較對照組增加，p38抑制劑SB203580預(yù)處理組細(xì)胞中PARP及Csapase3裂解片段蛋白表達(dá)水平較僅病毒感染組顯著減少，提示NDV/FMW誘導(dǎo)Caco2細(xì)胞依賴于p38MAPK通路，p38MAPK通路參與NDV/FMW引起的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

本研究在細(xì)胞水平上驗(yàn)證NDV/FMW對Caco2細(xì)胞株有促進(jìn)Caspase依賴性細(xì)胞凋亡作用，還進(jìn)一步證明p38MAPK通路在NDV/FMW誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中起重要作用，為NDV對結(jié)腸癌細(xì)胞的溶瘤潛力及其機(jī)制提供了理論依據(jù)。本研究觀察了NDV對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，后續(xù)有待開展動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，以進(jìn)一步明確NDV在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用價(jià)值。