石凱燕， 張春雪， 王藝靜， 王 臻， 孫 毅，2

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化中心，上海 200065)

中風(fēng)已躍居成為世界第2位、中國(guó)第1位的死亡因素，其中，缺血性腦卒中是主要的中風(fēng)類(lèi)型[1]。缺血性腦卒中可造成神經(jīng)細(xì)胞永久性壞死和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致患者神經(jīng)功能受損。腦缺血可觸發(fā)一系列以炎癥為主要特點(diǎn)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。首先，缺血缺氧導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死，產(chǎn)生活性氧類(lèi)(ROS)等神經(jīng)毒性物質(zhì)，導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活并產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子；其次，趨化因子和黏附因子表達(dá)量的上調(diào)，導(dǎo)致血腦屏障破壞，進(jìn)而導(dǎo)致血源性單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等外周免疫細(xì)胞趨化并浸潤(rùn)腦實(shí)質(zhì)；此外，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎癥細(xì)胞因子及一氧化氮、基質(zhì)金屬蛋白酶等多種細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而損傷神經(jīng)細(xì)胞并引起腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化[2]。

早期臨床治療缺血性腦卒中常采用藥物溶栓及機(jī)械取栓等以恢復(fù)血液灌流，然而該治療手段受6h時(shí)間窗的限制，且容易導(dǎo)致神經(jīng)二次損傷和出血性轉(zhuǎn)化，因此缺血性腦卒中尚缺乏安全有效的治療方法[3-4]。近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞治療可有效延長(zhǎng)時(shí)間窗，為腦卒中的治療提供了新的策略。其中，人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells derived from Wharton’s jelly, WJ-MSC)來(lái)源廣、取材方便、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，是理想的干細(xì)胞類(lèi)型。MSCs在體內(nèi)外均具有免疫調(diào)控特性。Ramasamy等[5]發(fā)現(xiàn)MSCs與成熟DC細(xì)胞共培養(yǎng)，可上調(diào)IL-10的表達(dá)，下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的表達(dá)。MSCs還可抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ等[6]。MSCs的這一特性為缺血性腦卒中的治療提供了可能。Yoo等[7]的研究表明，MSCs通過(guò)分泌TGF-β而降低外周免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而改善腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能。此外，Wang等[8]發(fā)現(xiàn)MSCs通過(guò)抑制NF-κB的激活，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS和IL-1β，進(jìn)而降低腦損傷。以上研究表明，WJ-MSCs治療腦缺血疾病的機(jī)制可能與MSCs調(diào)控炎癥因子表達(dá)及小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化有關(guān)?；诖?，本研究旨在通過(guò)細(xì)胞移植探究WJ-MSCs對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)炎癥的影響，為腦卒中疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8～9周齡清潔級(jí)野生型C57BL/6小鼠96只，均為雄性，體質(zhì)量25～30g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)將96只鼠分為假手術(shù)組、PBS處理組、WJ-MSCs細(xì)胞移植組，每組32只。

1.2 試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、血清替代物、肝素鈉、Trypsin-EDTA(0.25%)、磷酸鹽緩沖液購(gòu)自Gibco公司；戊巴比妥鈉(P11011)購(gòu)自德國(guó)Merck公司；異氟烷(R510-22)購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；5-溴-2′-脫氧尿苷(B5002)購(gòu)自Sigma公司；異丙醇(40049962)、無(wú)水乙醇(10009218)購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)有限公司；Nuclease-Free水(AM9932)購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；4%多聚甲醛(P1110)、蔗糖(S8270)、Triton-100(T8200)購(gòu)自北京索萊寶公司；Fluoromount-G熒光封片劑(0100-01)購(gòu)自Sou-thern Biotechnology Associates公司；兔抗小鼠Iba1多克隆抗體(anti-Iba1，019-19741)購(gòu)自日本W(wǎng)AKO和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；大鼠抗小鼠Brdu單克隆抗體(ab6326)、兔抗小鼠NeuN單克隆抗體(anti-NeuN，ab177487)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；TRIzol(15596018)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；驢抗兔Alexa Fluor 488二抗(711-546-152)、驢抗兔Cyanine3二抗(711-166-152)、驢抗大鼠二抗Alexa Fluor 488(712-545-150)、驢血清(Y2-017-111-121-10)購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司；Prime-Script-TMRTreagent Kit、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司。RT-qPCR引物由Thermo公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

黏附載玻片(80312-3161-16)購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司、蓋玻片(12-548-5M)購(gòu)自Fisherfinest公司、桌面數(shù)顯腦立體定位儀(68025)購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司;微量注射泵(Harvard Pump 11 Elite)購(gòu)自哈佛儀器有限公司；線栓(L1800-100)購(gòu)自廣州佳靈生物技術(shù)有限公司；小動(dòng)物麻醉機(jī)(R540IP)購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；NikonSMZ800體式顯微鏡購(gòu)自日本尼康；Hamilton微量注射器(7642-01)購(gòu)自美國(guó)Hamilton公司；玻璃微電極(415-883-0128)購(gòu)自Sutter instrument公司；手術(shù)剪、眼科鑷、彎鑷購(gòu)自上海醫(yī)療器械股份有限公司；醫(yī)用真絲編織線(F603)購(gòu)自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司；動(dòng)物術(shù)后恢復(fù)箱(5103型)購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；冰凍切片機(jī)(CM1905)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司；激光共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)(Zeiss LSM 800)購(gòu)自德國(guó)卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型制備 參照文獻(xiàn)[9]報(bào)道，采用頸總動(dòng)脈直接插線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion, MCAO/R)模型，手術(shù)操作均在SPF清潔級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行，且遵循無(wú)菌原則，方法如下。隨機(jī)取64只小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(10mL/kg)進(jìn)行麻醉，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。對(duì)頸部剃毛并消毒，采用手術(shù)剪做頸部正中切口，鈍性分離皮下各層組織，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用6-0手術(shù)線環(huán)繞頸總動(dòng)脈以作提拉,阻斷血流。在距頸動(dòng)脈叉近端0.7～0.8cm處結(jié)扎頸總動(dòng)脈,近端0.3～0.4cm處用顯微手術(shù)剪剪一小切口，將硅膠頭包被的線栓通過(guò)切口插入,經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,阻斷血流。60min后拔除線栓，縫合皮膚并消毒頸部。另取32只小鼠為假手術(shù)組，即只分離頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，不插栓。

1.3.2 WJ-MSCs的體外貼壁培養(yǎng) 人臍帶來(lái)源的WJ-MSCs來(lái)自同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化研究中心，細(xì)胞培養(yǎng)采用無(wú)血清體系，WJ-MSCs培養(yǎng)于含5%血清替代物和0.032%肝素鈉抗凝劑的DMEM/F12培養(yǎng)基中，待細(xì)胞匯合至85%，按1∶3進(jìn)行傳代。

1.3.3 細(xì)胞移植 采用胰酶法消化收集第3代WJ-MSCs，用1×PBS制成細(xì)胞密度為1.25×108個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。本實(shí)驗(yàn)采用腦立體定位移植法： 細(xì)胞移植組小鼠于造模后24h，使用異氟烷裝置面罩進(jìn)行麻醉維持，氣體濃度為2%。對(duì)小鼠頭部剃毛、消毒并暴露顱骨，以Bregma點(diǎn)為坐標(biāo)零點(diǎn)，使用顱骨鉆于AP=0mm，ML=2.3mm處鉆一骨窗，玻璃微電極下針深度為2.3mm，使得注射針在腦內(nèi)留針2min。設(shè)置微量注射泵輸注速度為50nL/min，注射0.4μL(細(xì)胞數(shù)5×104)細(xì)胞懸液，注射完成后留針靜置4min，隨后緩緩抬起注射針；PBS組注入等量濃度0.01mol/L的PBS溶液；假手術(shù)組不作處理。術(shù)后縫合皮膚并于37℃動(dòng)物術(shù)后恢復(fù)箱對(duì)小鼠進(jìn)行保溫。各組取6只小鼠于細(xì)胞移植后腹腔注射劑量為100mg/(kg·d)的BrdU溶液，持續(xù)5d。

1.3.4 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組、PBS處理組以及細(xì)胞移植組各10只小鼠于術(shù)前及術(shù)后1、6、12、18、24d進(jìn)行評(píng)分，參考國(guó)際公認(rèn)的小鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分量表(modified neurological severity scores, mNSS)[10]。評(píng)分內(nèi)容包括運(yùn)動(dòng)測(cè)試(提尾及行走測(cè)試)、感覺(jué)測(cè)試(視覺(jué)/觸覺(jué)及本體感覺(jué)測(cè)試)以及平衡能力測(cè)試(平衡木測(cè)試)等方面。1～6分為輕度梗死，7～12分為中度梗死，13～18分為重度梗死。將造模后第1天mNSS評(píng)分為7～12分的中度梗死小鼠納為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)采用雙盲評(píng)分方法，每只動(dòng)物重復(fù)評(píng)價(jià)3次。

1.3.5 RT-qPCR 術(shù)后6d時(shí)，對(duì)假手術(shù)組、PBS組以及細(xì)胞移植組各8只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(10mL/kg)進(jìn)行麻醉，用1×PBS進(jìn)行灌注，將小鼠斷頭取腦，使用解剖鑷將小鼠大腦分為左右半腦，采用TRIzol法提取小鼠缺血側(cè)大腦半球組織總RNA。采用PrimeScriptTMRTreagent Kit，首先去除DNA，去除DNA的PCR反應(yīng)條件為42℃，2min；其次將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為： 37℃，15min；85℃，5s；4℃；使用試劑TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量,引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增程序結(jié)束，分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，用2-ΔΔCt表示炎癥因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 免疫組織熒光染色 術(shù)后6d時(shí)，對(duì)假手術(shù)組、PBS處理組以及細(xì)胞移植組各14只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(10mL/kg)進(jìn)行麻醉，用1×PBS進(jìn)行灌注，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦并在4%多聚甲醛中浸泡過(guò)夜，然后將大腦置于濃度15%、30%蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水，OCT包埋并置于-80℃保存。冠狀連續(xù)切片(厚度為10μm)，保留紋狀體部位；每隔6張切片取一張切片用PBS漂洗。BrdU染色組切片加2N鹽酸溶液于37℃孵育30min，棄掉鹽酸溶液，加0.1mol/L PH8.5的硼酸溶液孵育10min，PBS漂洗3次，每次10min。切片加染色封閉液，室溫封閉1h，吸取兔抗小鼠Iba1多克隆抗體(1∶500)和大鼠抗小鼠Brdu單克隆抗體(1∶100)進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記染色，吸取兔抗NeuN單克隆抗體(1∶300)進(jìn)行免疫熒光單標(biāo)記染色。于4℃孵育24h后，棄掉一抗并用PBS漂洗，滴加對(duì)應(yīng)二抗和DAPI(1∶1000)室溫避光孵育2h，PBS漂洗，切片滴加Mount封閉液封片。室溫避光晾干2d后，保存于4℃。

1.3.7 共聚焦顯微鏡圖像采集與細(xì)胞計(jì)數(shù) 應(yīng)用共聚焦顯微鏡對(duì)上述染色切片進(jìn)行觀察和拍攝。熒光信號(hào)DAPI、Alexa Fluor 488以及Cyanine3分別在激發(fā)波長(zhǎng)353、493、548nm和發(fā)射波長(zhǎng)465、517、561nm 下進(jìn)行熒光成像。設(shè)置Z-stackstep size為0.6μm進(jìn)行掃描。假手術(shù)組、PBS處理組以及細(xì)胞移植組的每只小鼠各取4張腦片，在20倍鏡下拍攝梗死灶以及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)相同位置的3個(gè)視野。應(yīng)用Imaris×64 9.2.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析： 計(jì)數(shù)每個(gè)視野的NeuN+細(xì)胞數(shù)量，由視野面積得出NeuN+細(xì)胞密度值并計(jì)算單只小鼠的細(xì)胞密度平均值；計(jì)數(shù)每個(gè)視野的Iba1+以及Iba1+Brdu+細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算Iba1+Brdu+細(xì)胞數(shù)目百分比并得到單只小鼠的百分比平均值；計(jì)數(shù)每個(gè)視野的Iba1+熒光信號(hào)面積，并計(jì)算單只小鼠的Iba1+熒光面積平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 WJ-MSCs表面標(biāo)志物鑒定及三系分化潛能檢測(cè)結(jié)果

間充質(zhì)干細(xì)胞的特性鑒定對(duì)于體內(nèi)外研究及干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用至關(guān)重要。參照2006年國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)提出的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，即MSCs表達(dá)： CD90、CD105、CD73和CD44，不表達(dá)： CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WJ-MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，陽(yáng)性率達(dá)95%以上，見(jiàn)圖1。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%時(shí)，消化傳代，按照每孔1.2×104的細(xì)胞數(shù)接種在24孔板中。使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)WJ-MSCs向骨、脂肪和軟骨方向分化。誘導(dǎo)培養(yǎng)2周或3周后，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂和成軟骨的染色鑒定，鑒定方法參照文獻(xiàn)[11]。染色結(jié)果表明WJ-MSCs具有極強(qiáng)的三系分化能力，見(jiàn)圖2。

2.2 WJ-MSCs顯著改善腦缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)功能

參考mNSS神經(jīng)功能損傷評(píng)分量表，對(duì)各組小鼠術(shù)前及術(shù)后1、6、12、18、24d進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分。假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能損傷。MCAO/R小鼠術(shù)后神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，且隨時(shí)間延長(zhǎng)均有所恢復(fù)。與PBS處理組相比，術(shù)后6d時(shí)，細(xì)胞移植組小鼠的轉(zhuǎn)圈行為得到改善，且mNSS評(píng)分低于PBS處理組，但無(wú)顯著性差異。術(shù)后12d(P<0.01)、18d(P<0.0001)、24d(P<0.0001)時(shí)，細(xì)胞移植組小鼠的mNSS評(píng)分均低于PBS組，且差距逐漸增大，表明WJ-MSCs改善了腦缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)功能，見(jiàn)圖3。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WJ-MSCs表面標(biāo)志物Fig.1 Flow cytometer analysis of WJ-MSCs

圖2 WJ-MSCs三系分化潛能Fig.2 Multilineage differentiation of WJ-MSCsA： 成骨染色;B： 成脂染色;C： 成軟骨染色

2.3 WJ-MSCs顯著降低大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元變性丟失

NeuN免疫熒光染色及全腦共聚焦掃描結(jié)果顯示，MCAO/R小鼠缺血側(cè)大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)的NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞核皺縮，數(shù)目明顯減少，且形成了明顯的邊界，見(jiàn)圖4A、圖4B。與PBS處理組小鼠相比，細(xì)胞移植組小鼠缺血側(cè)大腦梗死灶[(374.5±24.94)vs(618.8±61.11) 個(gè)/mm2，P<0.01]及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)[(444.9±78.79)vs(760.8±51.59) 個(gè)/mm2，P<0.01]的存活神經(jīng)元數(shù)量分別增加了65%、71%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4C。

圖3 腦缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能損傷評(píng)分Fig.3 Quantification of neurologic function scores at different time points after MCAO與PBS處理組相比，**P<0.01，***P<0.0001；ns： 無(wú)顯著變化；n=10

2.4 神經(jīng)炎癥相關(guān)基因表達(dá)量的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果

為探究WJ-MSCs對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)炎癥因子mRNA表達(dá)量的影響，本研究對(duì)相關(guān)抗炎因子和促炎因子實(shí)施了RT-qPCR的檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，MCAO/R小鼠缺血側(cè)大腦神經(jīng)炎癥因子的mRNA表達(dá)量均明顯上調(diào)；與PBS處理組小鼠相比，細(xì)胞移植組小鼠缺血側(cè)大腦抗炎因子TGF-β1、IL-10的mRNA表達(dá)量明顯升高，差異具有顯著性意義(P<0.05)。同時(shí)，細(xì)胞移植組小鼠缺血側(cè)大腦促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，IFN-γ則無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖5。

2.5 WJ-MSCs顯著抑制大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化和增殖

為探究WJ-MSCs移植對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠缺血側(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)使用小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物Iba1和增殖標(biāo)記物BrdU進(jìn)行了免疫熒光雙標(biāo)記染色。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組小鼠相比，MCAO/R小鼠缺血側(cè)大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞明顯活化，其胞體變大，突起縮短，由細(xì)長(zhǎng)分支狀變?yōu)閳A形或“阿米巴狀”，且顯著增殖；與PBS處理組小鼠相比，細(xì)胞移植組小鼠缺血側(cè)大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)的Iba1陽(yáng)性細(xì)胞活化程度分別降低了31.5%、19.8%[(61.18±7.990)×103vs(41.92±1.942)×103μm2，(47.36±2.609)×103vs(37.98±2.415)×103μm2，均P<0.05]，且增殖中的Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分別降低了23.4%、16.7%[(58.80±1.594)vs(45.04±5.448) 個(gè)/mm2，(58.28±2.539)vs(48.57±2.970) 個(gè)/mm2，均P<0.05]，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6。

圖4 WJ-MSCs顯著降低大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)的神經(jīng)元變性丟失Fig.4 WJ-MSCs significantly alleviated degeneration and damage of neurons in infarcts and marginal cortex after MCAO/RA： NeuN(綠色)免疫熒光染色；B： 缺血側(cè)大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)進(jìn)行共聚焦掃描拍照的區(qū)域；C： NeuN陽(yáng)性細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)比較，n=8，**P<0.01

圖5 腦缺血再灌注損傷小鼠缺血側(cè)大腦半球炎癥因子的mRNA表達(dá)量檢測(cè)Fig.5 RT-qPCR shows the expression of inflammatory factors in ischemic hemisphere與PBS處理組相比，*P<0.05；ns： 無(wú)顯著變化，n=8

圖6 WJ-MSCs顯著抑制腦缺血再灌注小鼠缺血側(cè)大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化和增殖Fig.6 WJ-MSCs significantly inhibit activation and proliferation of microglia/macrophage in infarcts and marginal cortex after MCAO/RA： Iba1(紅色)/BrdU(綠色)免疫熒光染色；B： 白色方框b中的放大圖像；C： 小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化情況統(tǒng)計(jì)；D： 小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞增殖情況統(tǒng)計(jì)；*P<0.05，n=6

3 討 論

WJ-MSCs指分離自人臍帶華氏膠組織的間充質(zhì)干細(xì)胞。WJ-MSC來(lái)源廣、取材方便、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，且易于分離培養(yǎng)，增殖能力旺盛。此外，WJ-MSCs不表達(dá)MHC Ⅱ 類(lèi)分子，低表達(dá)或不表達(dá)MHC Ⅰ 類(lèi)分子，因此免疫原性低[12]。不僅如此，WJ-MSCs可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，進(jìn)而改善神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和代謝狀況[13]；研究還發(fā)現(xiàn)，WJ-MSCs具有抗炎的免疫調(diào)控特性[14]?；谝陨咸匦裕琖J-MSCs廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中疾病的研究中。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠顯著促進(jìn)缺血損傷腦組織修復(fù)、降低腦梗死體積、改善血腦屏障損傷，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的改善[15-16]。本實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證了WJ-MSCs對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠具有顯著的治療效果，這體現(xiàn)在WJ-MSCs增加了MCAO/R小鼠缺血側(cè)大腦梗死灶及梗死灶周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)的存活神經(jīng)元數(shù)目并促進(jìn)了行為學(xué)的改善。有研究表明MSCs移植可促進(jìn)腦缺血小鼠大腦內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，此外，MSCs可遷移至腦損傷區(qū)域并部分分化為神經(jīng)元[17-18]。然而，大量研究認(rèn)為MSCs通過(guò)免疫調(diào)控以及旁分泌作用進(jìn)而調(diào)控炎癥微環(huán)境、降低神經(jīng)元變性丟失是促進(jìn)缺血性腦卒中神經(jīng)功能改善的主要機(jī)制[19]。

本研究選取炎癥細(xì)胞因子TGF-β1、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ作為研究對(duì)象，以探究WJ-MSCs對(duì)腦缺血損傷小鼠神經(jīng)炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響。TGF-β1、IL-10是在腦缺血損傷中降低炎癥反應(yīng)的抗炎因子。TGF-β對(duì)體外培養(yǎng)的脂多糖激活的小膠質(zhì)細(xì)胞具有持續(xù)的抗炎效果，并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用[20]。此外，TGF-β能夠促進(jìn)神經(jīng)元抗凋亡因子基因表達(dá)，抑制神經(jīng)元的凋亡[21]。IL-10可顯著降低腦缺血后局部中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制TNF-α、IL-6以及IL-2等炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)而減輕腦損傷[22]。TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ是在腦缺血損傷中促發(fā)炎癥反應(yīng)的促炎因子。TNF-α由巨噬細(xì)胞合成，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的激活并表達(dá)黏附因子，繼而加重缺血腦組織損傷；IL-1β主要來(lái)源于膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞，其過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，釋放有害炎性介質(zhì)，進(jìn)而加重腦損傷[23]。IL-6主要來(lái)源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，其可作為炎癥生物標(biāo)志物，對(duì)缺血性中風(fēng)的臨床診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要意義[24]。IFN-γ由激活的胸腺來(lái)源的T細(xì)胞和NK細(xì)胞所分泌，其亦可加重炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗炎細(xì)胞因子基因mRNA表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，促炎細(xì)胞因子基因TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)量均受到明顯抑制(P<0.05)，IFN-γ的mRNA表達(dá)量有下降的趨勢(shì)，但不顯著，可能是出于樣本量較少的原因。

小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是防御腦缺血損傷的主要免疫細(xì)胞。腦缺血損傷后，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和血源性單核細(xì)胞在病變區(qū)域中轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，發(fā)揮著免疫防御和免疫損傷的雙重作用。小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通常負(fù)責(zé)吞噬細(xì)胞碎片、清除死亡的神經(jīng)細(xì)胞并釋放營(yíng)養(yǎng)因子，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能改善。然而，缺血性腦卒中觸發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)使小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞激活、增殖，并產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子和ROS、iNOS、NO等神經(jīng)毒性物質(zhì)，進(jìn)而損傷神經(jīng)元，影響神經(jīng)功能[25]。此外，2015年，Jolivel等[26]發(fā)現(xiàn)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血半暗帶可通過(guò)吞噬作用直接吞噬內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致腦血管解體，血腦屏障破壞，從而進(jìn)一步促使外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，加重腦損傷。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化在腦缺血損傷發(fā)生中起著重要的作用。既往的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞移植可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的激活并改善神經(jīng)功能。Hocum-Stone等[27]的研究表明，人源臍帶血干細(xì)胞治療局灶性腦缺血模型可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活并降低巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而降低腦梗死體積并改善神經(jīng)功能。此外，Lin等[28]也證明了人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞顯著抑制了腦缺血損傷模型的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化。與此相反的是，Yang等[29]發(fā)現(xiàn)，造模后1d靜脈移植BMSC顯著增加了梗死灶周?chē)鷧^(qū)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。不同的細(xì)胞來(lái)源、不同的抗體標(biāo)志物選擇以及不同的研究手段可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生差異的原因。

綜上所述，WJ-MSCs腦立體定位移植改善了MCAO/R小鼠神經(jīng)功能并抑制了大腦神經(jīng)炎癥，然而潛在的免疫調(diào)控機(jī)制尚需深入研究。