孔祥君，任同同，許維娜,3*

（1. 煙臺邁百瑞國際生物醫(yī)藥有限公司，山東煙臺 264006；2. 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（葡萄酒學(xué)院），山東煙臺264003；3. 煙臺張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司/山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺 264001）

混菌發(fā)酵是指利用兩種或兩種以上的微生物，聯(lián)合完成某種發(fā)酵過程的新型技術(shù)，是在單菌株純培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)上的創(chuàng)新[1]。在葡萄汁發(fā)酵為葡萄酒的過程中，不同酵母菌發(fā)揮的作用是不同的，通?；炀l(fā)酵能使發(fā)酵產(chǎn)品表現(xiàn)出更好的特性[2]。多酵母混合發(fā)酵可利用菌株之間的協(xié)同作用，使發(fā)酵底物的利用率增高、發(fā)酵產(chǎn)率提高，并可產(chǎn)生、增強(qiáng)一些有益風(fēng)味的化合物，如酯類、揮發(fā)性酚類等，或者降解某些不良?xì)馕段镔|(zhì)如乙醛、乙酸等，從而改善葡萄酒的風(fēng)味特征，使發(fā)酵酒風(fēng)味更加豐富、濃郁[3-6]。混菌發(fā)酵并不是幾種酵母菌株的隨意組合，要選擇在發(fā)酵中能產(chǎn)生明顯互利互補(bǔ)作用的菌株。此外，各種酵母菌株的接種比例和接種順序也會對發(fā)酵酒質(zhì)量產(chǎn)生影響，例如，趙芳琴等[7]發(fā)現(xiàn)將梅奇酵母（Mstschnikowia）和釀酒酵母（Saccharomyces）按1∶1的接種比例進(jìn)行混菌發(fā)酵，可有效提升‘美樂’低醇葡萄酒的香氣品質(zhì)；許維娜等[9]發(fā)現(xiàn)，速度型釀酒酵母與風(fēng)味型釀酒酵母接種比例為1∶4時，葡萄酒的香氣更加豐富、濃郁，酒的感官質(zhì)量最好；曾朝珍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，先接種異常漢遜酵母24 h后接種釀酒酵母，發(fā)酵的蘋果白蘭地風(fēng)味物質(zhì)最復(fù)雜，品質(zhì)及風(fēng)味最好。

目前，針對葡萄酒混菌發(fā)酵的研究多采用釀酒酵母與非釀酒酵母 [如有孢圓酵母（Torulaspora）、梅奇酵母、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora）、隱球酵母（Cryptococcus）、畢赤酵母（Pichia）、假絲酵母（Candida）等] 混合發(fā)酵[4-6,10]，但很多非釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)品存在一些食品安全隱患[8]，采用不同種類、優(yōu)勢互補(bǔ)的釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵，將獲得更安全的產(chǎn)品。

本研究采用兩株野生釀酒酵母，即速度型發(fā)酵酵母和風(fēng)味型發(fā)酵酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，將兩酵母按照不同的順序接種到葡萄汁中，通過比較分析各發(fā)酵液樣品的基礎(chǔ)理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)含量、感官質(zhì)量得到最優(yōu)的菌株接種順序，從而探索較佳的混菌發(fā)酵工藝，釀造出具有更高品質(zhì)的葡萄酒。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

釀酒酵母S2，速度型發(fā)酵菌株，分離自煙臺大柳行葡萄基地；釀酒酵母F6，風(fēng)味型發(fā)酵菌株，分離自平度大澤山某葡萄基地；釀酒葡萄‘蛇龍珠’取自煙臺蓬萊某葡萄園，壓榨取汁。葡萄汁的總糖220 g/L，pH 3.57，總酸5.8 g/L。

表1 兩種酵母的接種量與接種時間Table 1 Inoculation volume and time of two yeasts/(cfu/mL)

1.2 主要試劑和設(shè)備

葡萄糖、瓊脂、氫氧化鈉、斐林A液、斐林B液，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉，英國OXFID公司；鹽酸、NaCl試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；3-辛醇，山東天海有限公司。

UV1800紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器有限公司；TSQ8000Evo氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；附溫度計(jì)密度瓶，上海壘固儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母種子液制備與濃度測定

將斜面保藏的釀酒酵母S2和F6分別單獨(dú)接種到配置好的新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，按5%接種至葡萄汁中，再25 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，重復(fù)2次得到種子液。

酵母種子液適度稀釋后，用紫外分光光度法測定其吸光度值（OD600）。酵母菌濃度的計(jì)算公式：酵母菌濃度/(cfu/mL)＝OD600×稀釋倍數(shù)×107，以此為依據(jù)計(jì)算接種量。

1.3.2 接種與發(fā)酵

酵母菌S2與F6的接種比例為1∶1，接種總菌濃度為2×106cfu/mL。共設(shè)6個試驗(yàn)組，接種方法如表1所示。設(shè)置同時接種組（處理1、2）、優(yōu)先接種速度型發(fā)酵菌組（處理3、4）、優(yōu)先接種風(fēng)味型發(fā)酵菌組（處理5、6）。每個試驗(yàn)設(shè)3個平行，24～26 ℃進(jìn)行發(fā)酵。

發(fā)酵開始后，每天檢測比重、CO2失重量，待上述指標(biāo)基本穩(wěn)定，不再發(fā)生變化時結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液過濾澄清后進(jìn)行倒罐。

1.3.3 發(fā)酵液基本理化指標(biāo)檢測

發(fā)酵完成倒罐澄清后獲得發(fā)酵液進(jìn)行理化指標(biāo)檢測?？偺桥c還原糖測定采用斐林滴定法，總酸的測定采用酸堿滴定法，酒精度的測定采用密度瓶法[11]。

1.3.4 發(fā)酵液香氣成分檢測

發(fā)酵液中香氣物質(zhì)成分分析采用固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法（HS-SPME-GC/MS）[12-14]。從各酒樣中分別吸取5 mL放入萃取瓶中，添加1.5 g氯化鈉、200 μL濃度為100 mg/L的3-辛醇，45 ℃水浴平衡30 min。將進(jìn)樣器萃取針插入瓶內(nèi)萃取50 min，待吸附平衡后將進(jìn)樣器插入氣相色譜進(jìn)樣口解析10 min，開始GC-MS檢測。GC條件為：載氣He；流速1.2 mL/min；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣比1∶1.5；進(jìn)樣量10 μL；檢測器溫度250 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃。MS條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

分離到的香氣成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合計(jì)算機(jī)圖譜庫NIST11、相同色譜條件下該物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，采用3-辛醇做內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。再根據(jù)樣品保留時間確認(rèn)每個香氣物質(zhì)的化學(xué)成分。對于沒有標(biāo)準(zhǔn)化合物的定性目標(biāo)峰，采用與目標(biāo)香氣物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量相近的化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得出的峰面積與3-辛醇面積進(jìn)行對比，得到其質(zhì)量濃度。

1.3.5 感官評價

參照GB 15038-2006中的香氣評判方法[15]，由13名品酒員組成品評小組對發(fā)酵液進(jìn)行外觀、香氣、口感三個方面的綜合感官評價，其中外觀包括澄清度和掛杯（10分）、色澤（10分），香氣包括香氣特性（20分）、協(xié)調(diào)性（20分），口感包括口感特性（20分）、協(xié)調(diào)性（20分）。

表2 發(fā)酵樣品理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indexes of fermented samples

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

各發(fā)酵液樣品的總糖、還原糖、總酸和酒精度測定結(jié)果如表2所示。所有發(fā)酵樣品的殘?zhí)蔷?.17～3.83 g/L，總酸在4 g/L左右，酒精度在12.08%～12.67%。總體而言，同時接種組和優(yōu)先接種速度型發(fā)酵菌組發(fā)酵效率略高。

2.2 香氣物質(zhì)檢測結(jié)果

通過HS-SPME-GC/MS的方法對樣品中香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測出36種香氣成分，大致分為酯類（19種）、酸類（9種）、醇類（6種）、醛類（2種）4大類。不同酒樣所含的香氣物質(zhì)的種類和含量均有差異。

酯類化合物是葡萄酒中重要的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)，其比例協(xié)調(diào)對葡萄酒香氣有正增效作用[16-17]。如表3所示，6個樣品中共有19種酯類物質(zhì)被檢出，其中處理1～6各檢出11、10、11、11、11、9種。癸酸乙酯、9-癸酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯在各樣品中的含量相對較高，它們都主要呈現(xiàn)花果香氣，其中含量最高的癸酸乙酯貢獻(xiàn)果香香氣[18-19]。酯類物質(zhì)總含量最高的為處理3，其次為處理5、6、4，同時接種組（處理1、2）的酯類物質(zhì)含量相對較低。

酸類物質(zhì)主要使葡萄酒呈現(xiàn)出一些粗糙、不愉悅的氣味，然而，它能抑制芳香酯的水解，并起到平衡酒體的重要作用，因此對于香氣平衡具有重要作用[20]。如表4所示，6個樣品中共有9種酸類物質(zhì)被檢出，處理1～6各檢出8、3、6、5、4、4種，酸類物質(zhì)種類與含量最高的為處理1。各發(fā)酵液樣品中含量較高的酸類有辛酸、月桂酸、癸酸，主要賦予葡萄酒水果香氣、月桂油味等氣味[21]。整體而言，各樣品中酸類物質(zhì)含量較低（低于20 mg/L），會對葡萄酒香氣產(chǎn)生良好的影響[8]。

表3 酒樣中酯類物質(zhì)含量Table 3 Contents of esters in wine samples/(mg/L)

表4 酒樣中酸類物質(zhì)含量Table 4 Contents of acids in wine samples/(mg/L)

葡萄酒中的醇類物質(zhì)來源于葡萄漿果或在酒精發(fā)酵期間產(chǎn)生[22]。高級醇主要為葡萄酒貢獻(xiàn)植物類香氣，適當(dāng)濃度的高級醇能夠增加葡萄酒香氣的復(fù)雜度和協(xié)調(diào)性，使酒體醇厚、豐滿[23]。如表5所示，6個樣品中共有6種醇類物質(zhì)被檢出，其中處理1～6各檢出6、4、6、5、4、4種。各發(fā)酵液樣品中含量較高的醇類為苯乙醇和3-甲基丁醇，分別呈現(xiàn)花香味和燒焦味、酒精味[19]。醇類物質(zhì)種類與含量較高的為處理1、3、5?？傮w而言，第1天＋第2天接種（處理1、3、5）的樣品醇類含量略高于第1天＋第3天接種（處理2、4、6）的組別。

如表6所示，6個發(fā)酵液樣品中有2種醛類物質(zhì)被檢出，為壬醛和癸醛，分別賦予葡萄酒玫瑰、柑橘香和甜香、花香[21]，以處理5中含量略高（主要為壬醛），其他樣品中含量均較低。

表5 酒樣中醇類物質(zhì)含量Table 5 Contents of alcohols in wine samples/(mg/L)

表6 酒樣中醛類化合物含量Table 6 Contents of aldehydes in wine samples/(mg/L)

圖1 各酒樣的感官分析結(jié)果Figure 1 Results of sensory analysis

2.3 感官品評結(jié)果

各酒樣的感官品評結(jié)果如圖1所示。結(jié)合外觀、香氣和口感指標(biāo)，綜合評分由高到低依次是處理3、5、1、2、4、6。先接種速度發(fā)酵酵母S2、較風(fēng)味發(fā)酵菌F6提前1 d的處理3所得酒樣的果香和發(fā)酵香更加明顯，香氣和口感更加平衡，得分最高。綜合而言，各樣品間感官指標(biāo)差異較小，采用第1天+第2天接種（處理1、3、5）的實(shí)驗(yàn)組感官表現(xiàn)略好于第1天+第3天接種（處理2、4、6）組別。

3 討論與結(jié)論

本研究將速度發(fā)酵酵母與風(fēng)味發(fā)酵酵母按照不同的順序接種到‘蛇龍珠’葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵，通過對發(fā)酵液理化指標(biāo)、香氣物質(zhì)、感官指標(biāo)的比較，探索混菌發(fā)酵中接種順序?qū)Πl(fā)酵酒質(zhì)量的影響。結(jié)果表明，同時接種組和優(yōu)先接種速度型發(fā)酵菌組發(fā)酵效率略高；優(yōu)先接種速度型發(fā)酵菌組和優(yōu)先接種風(fēng)味型發(fā)酵菌組酯香物質(zhì)含量較高。感官品評結(jié)果表明，采用第1天＋第2天接種的試驗(yàn)組感官表現(xiàn)略好于第1天＋第3天接種組別，處理3樣品果香和發(fā)酵香明顯，香氣和口感協(xié)調(diào)，得分最高。綜合分析認(rèn)為，在混菌順序發(fā)酵過程中，采用處理3的方法，即先接種速度發(fā)酵酵母S2、第2天再接種風(fēng)味發(fā)酵菌F6，所得到的發(fā)酵酒質(zhì)量最好。曾朝珍等[9]同樣發(fā)現(xiàn)適宜的混菌發(fā)酵接種順序可提高酯類、醇類物質(zhì)含量，提高蘋果白蘭地的品質(zhì)及風(fēng)味；袁曉龍等[24]的鴨梨酒工藝實(shí)驗(yàn)也證實(shí)混菌發(fā)酵的接種順序?qū)Πl(fā)酵酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)、感官指標(biāo)有一定影響。因此，混菌發(fā)酵過程中接種順序是影響發(fā)酵酒質(zhì)量的重要因素之一，適當(dāng)?shù)慕臃N順序有助于獲得高品質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)品。

混菌發(fā)酵對提升葡萄酒質(zhì)量、突出葡萄酒個性有重要意義。本試驗(yàn)采取的混菌發(fā)酵方式是以不同順序接種兩種釀酒酵母，探究較佳的發(fā)酵方式，接下來也可以在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索接種順序和接種比例優(yōu)化的復(fù)合效果，探索最優(yōu)的混菌發(fā)酵工藝。