杜發(fā)祥 許菊霞 杜雪琴 繆樹婷

摘 要：目的：提升食品檢測機構的檢測能力，同時結合本次能力驗證實驗，總結食品中沙門氏菌檢測過程中的關鍵控制要素，尋找操作中的問題，討論控制措施。方法：依據我國食品藥品檢驗研究院下發(fā)的能力驗證作業(yè)指導書、國家標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》GB 4789.4-2016要求的檢驗方法對編號為CODE0477、CODE0884、CODE0861的3份巧克力樣品中的沙門氏菌進行增菌、分離、生化、血清學鑒定。結果：CODE0477、CODE0884未檢出沙門氏菌，CODE0861結果為檢出沙門氏菌，3份檢測樣品的檢測結果評價均為滿意。結論：通過能力驗證實驗可提升檢驗檢測水平，同時也為處理細菌性食物中毒原因奠定了基礎。

關鍵詞：能力驗證;沙門氏菌;食品;鑒定

在我國，細菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起的，而且大多數來源于動物性食品，沙門氏菌菌型繁多，分布廣泛，是重要的人畜共患病原體[1]。據統計，由沙門氏菌引起的食物中毒事件在世界各國的細菌性食物中毒種類中常列榜首[2]。通常沙門氏菌會通過污染食物引起食物中毒事件，人體受感染后在毒素作用下導致胃腸炎、傷寒和副傷寒，平均發(fā)病時間為12～24 h，愈后良好。沙門氏菌的傳播方式眾多，可通過肉、蛋、環(huán)境以及無癥狀帶菌者傳播，在食品餐飲業(yè)加工銷售過程中易受到污染，因此能否在食品和食物中毒事故調查中及時成功分離鑒別出該菌極為重要。本實驗室結合本次能力驗證實驗，總結食品中沙門氏菌檢測過程中的關鍵控制要素，討論控制操作中的問題。

1 材料和方法

1.1 待檢樣品

沙門氏菌驗證實驗待檢樣品為：編號CODE0477、CODE0884、CODE0861的巧克力3份，樣品包裝具塞玻璃瓶密封包裝，寄送加冰袋，樣品接收時包裝完好無損壞。

1.2 培養(yǎng)基、試劑和材料

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂與三糖鐵（TSI）瓊脂采購自廣東環(huán)凱微生物有限公司;蛋白胨水、靛基質試劑、尿素生化管（pH7.2）、氰化鉀 （KCN）生化管和賴氨酸脫羧酶試驗生化管采購自北京路橋技術股份有限公司;沙門氏菌多價診斷血清采購于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。無菌錐形瓶、試管等均有本實驗室自行消毒后使用;微量移液器吸頭、無菌培養(yǎng)皿均為一次性使用材料。

1.3 儀器和設備

生化培養(yǎng)箱（SPX-250-Ⅱ上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、均質器（BagMixerp?400）、電子天平（AE523C 上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、手提式壓力蒸汽滅菌鍋（DSX-280KB30 上海申安醫(yī)療器械廠）、生物安全柜（HR40-ⅡA2）和顯微鏡（DSZ200000X 重慶澳浦光電技術有限公司）。

1.4 實驗方法

中國食品藥品檢驗研究院能力驗證作業(yè)指導書、國家標準GB 4789.4-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》。

1.4.1 預增菌

按照能力驗證作業(yè)指導要求，直接取待檢巧克力10 g樣品，置于盛有90 mL緩沖蛋白胨水（BPW）的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打2 min。直接放入培養(yǎng)箱內（36±1） ℃培養(yǎng)18? h。

1.4.2 增菌

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1 mL，轉種于10 mL TTB內，于（42±1）℃培養(yǎng)24 h。同時，另取1 mL，轉種于10 mL SC內，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。

1.4.3 分離培養(yǎng)

取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板，（36±1）℃培養(yǎng)48 h;再取一環(huán)增菌液，劃線接種于一個XLD瓊脂平板上，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察各個平板上生長的菌落特征。

1.4.4 純培養(yǎng)和生化鑒定

從選擇性瓊脂平板上分別挑取2個可疑菌落，先做革蘭氏染色，然后再接種三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，直接接種蛋白胨水、尿素生化管（pH7.2）、氰化鉀（KCN）生化管，挑取的可疑菌落可直接進行沙門氏菌多價診斷血清試探性凝集實驗，觀察凝集結果。

2 結果與分析

2.1 菌落特征分析

觀察表1描述可知，編號為CODE0477、CODE0884的質控樣品在BS瓊脂菌落為黑色菌落、周邊培養(yǎng)基無顏色變化，XLD瓊脂平板上都生長有黑色菌落，CODE0861在BS瓊脂菌落為中心帶光澤的黑色菌落，XLD瓊脂上為帶金屬光澤的黑色菌落，菌落形態(tài)都均有沙門氏菌菌落生長特性，由于缺少顯色培養(yǎng)基的培養(yǎng)篩選，3份樣品中均有可能生長沙門氏菌，需要進一步生化反應鑒別。

2.2 生化鑒定

按照表2生化反應對照發(fā)現，三個樣品均分解葡萄糖、產氣、產硫化氫，賴氨酸脫羧酶試驗陽性（+），都為可疑沙門氏菌反應特性。但CODE0477、CODE0884樣品呈尿素酶（+），靛基質試驗陰性（-），將可疑菌落再次純化接種，進行尿素酶、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶試驗，仍為尿素陽性（+）、氰化鉀陰性（-）、賴氨酸脫羧酶陽性（+），對照國家標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》GB 4789.4-2016標準，認為可疑菌落有可能是沙門氏菌個別變種，需做血清學凝集試驗確定。CODE0861樣品培養(yǎng)24 h仍然不發(fā)酵尿素（-），且氰化鉀陰性（-）、賴氨酸脫羧酶陽性（+），靛基質陰性（-）是典型的沙門氏菌的生化反應。

2.3 血清凝集

對3份樣品在BS瓊脂和XLD瓊脂上生長的可疑菌落，先進行沙門氏菌多價試探性血清凝集，結果顯示CODE0477、CODE0884不凝集（-），CODE0861凝集（+），將營養(yǎng)瓊脂純化的菌落進行血清學凝集，結果顯示CODE0477、CODE0884 不凝集（-），CODE0861凝集（+），通過接種來提高瓊脂含量，培養(yǎng)和加熱消除Vi抗原等方法，反復凝集試驗結果顯示CODE0477、CODE0884 仍不凝集（陰性），由于缺乏分型鑒定血清，沒有繼續(xù)對CODE0861進行鑒定分型。綜合菌落生長特性、生化反應、血清凝集試驗結果分析，最終判定CODE0477、CODE0884樣品中為非沙門氏菌，而CODE0861樣品中為典型沙門氏菌。

3 討論

能力驗證是有效提升檢測能力的途徑，也是對實驗室環(huán)境、操作程序、技術進行質量控制的重要手段。本次能力驗證樣品是巧克力，目的菌是沙門氏菌，按照國家食品安全標準的相關步驟操作即可，在分離培養(yǎng)時由于缺少沙門氏菌顯色平板，不能有效直觀挑選可疑菌落，對后期生化反應和血清凝集試驗帶來一定困難，挑選可疑菌落時應選擇具有豐富經驗的檢驗人員進行操作，可先做試探性玻片凝集試驗，以增加挑選菌落的準確性，對菌落形態(tài)較為典型，但試探性凝集為陰性的菌落應進一步生化鑒定和多價凝集試驗，由于H抗原發(fā)育不良，造成假陰性的結果。生化鑒定中發(fā)現CODE0477、CODE0884兩個樣品發(fā)酵尿素非常迅速，這一特性需在食物中毒事故調查分離病原菌時引起高度重視，因近年來兩種及以上病原菌引起的食物中毒案例已有報道，為避免漏診一定要結合營養(yǎng)瓊脂菌落生長情況進行進一步的鑒定分析，通過此次能力驗證，在營養(yǎng)瓊脂菌液中對這兩個迅速發(fā)酵尿素的樣品進行觀察，未發(fā)現有“遷徙狀生長”現象，可以初步排除變形桿菌的干擾。

參考文獻

[1]王軍，鄭增忍，王晶鈺.動物源性食品中沙門氏菌的危險評估[J].中國動物檢疫，2007（4）：23-25.

[2]高晗，何娟，嚴禮.3種沙門氏菌檢測方法能力驗證[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（2）：510?515.