林 琦,李利君,2,3,伍 菱,2,3,黃高凌,2,3,,翁淑燚,倪 輝,2,3,李清彪,2,3,張樹文,黃幼林
(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021;3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心,福建 廈門 361021;4.大閩食品(漳州)有限公司,福建 廈門 361021;5.集美大學(xué)理學(xué)院,福建 廈門 361021)
茶葉是我國(guó)重要的農(nóng)產(chǎn)品,按照加工工藝的不同,茶葉可分為白茶、綠茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶共6大類。紅茶是一類傳統(tǒng)的茶葉,屬于全發(fā)酵茶,近年來產(chǎn)量快速增長(zhǎng),根據(jù)國(guó)際茶葉委員會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2018年全球紅茶產(chǎn)量600萬 t,比2017年全球紅茶產(chǎn)量增加了15.8萬 t。相關(guān)研究表明,紅茶富含多種生物活性物質(zhì),具有減肥消炎[1]、保護(hù)神經(jīng)[2]、預(yù)防心血管疾病[3]的功能。相關(guān)研究表明,茶葉水溶液經(jīng)過微生物發(fā)酵后,不僅具有顯著的抗氧化性和抗菌性等功能[4],而且具有特殊的風(fēng)味[5]。例如,采用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多菌種混合發(fā)酵的紅茶菌[6],具有預(yù)防糖尿病、改善腸道微生物,治療非酒精性脂肪肝等功能[7-8],并產(chǎn)生了豐富的醇類、醛類、酮類、酸類、酯類等物質(zhì)[9],使發(fā)酵后的茶葉具有更好的風(fēng)味。因此,利用微生物發(fā)酵增加茶葉水溶液及茶飲料的生物活性及風(fēng)味日漸成為茶葉深加工的重要技術(shù)手段。目前,相關(guān)研究對(duì)微生物發(fā)酵引起的茶葉活性進(jìn)行了大量研究,在此基礎(chǔ)上,深入研究微生物發(fā)酵對(duì)香氣的影響,將進(jìn)一步促進(jìn)高質(zhì)量茶葉產(chǎn)品的開發(fā)。
目前常見的香氣萃取方式有頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction,HS-SPME)、超聲輔助萃取[10]、攪拌棒吸附萃取[11]、同時(shí)蒸餾萃取[12]、靜態(tài)頂空[13]、溶劑輔助蒸發(fā)[14]、液液萃取[15]、超臨界萃取[16]、動(dòng)態(tài)頂空[16]等,其中,SPME具有人工操作快速、簡(jiǎn)單,集萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體的優(yōu)點(diǎn)。香氣成分分析檢測(cè)方法包括氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)[12]、氣相色譜-嗅聞[11]、氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜[17]、電子鼻[18]、氣相色譜-燃燒同位素比值質(zhì)譜法[19]、氣相色譜-氫火焰離子化法[20]等,其中GC-MS既有質(zhì)譜的高靈敏度和氣相色譜的高分辨率,又能準(zhǔn)確進(jìn)行定性和定量分析[21]。相關(guān)學(xué)者通過HS-SPME結(jié)合GC-MS分析研究,發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵后,鐵觀音浸提液的醇類、酮類和酯類香氣成分在發(fā)酵后較發(fā)酵前有明顯增加[22];Pripdeevech等[5]采用HS-SPME結(jié)合GC-MS分析,研究發(fā)現(xiàn)烏龍茶經(jīng)過枯草芽孢桿菌發(fā)酵后主要揮發(fā)性成分顯著增加。但是,目前對(duì)發(fā)酵茶葉水溶液及茶飲料風(fēng)味隨菌種變化的規(guī)律缺乏系統(tǒng)對(duì)比研究。
本研究以紅茶水溶液為對(duì)象,分別用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵,并采用感官評(píng)價(jià)和HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)比分析各菌種對(duì)茶葉香氣的影響,旨在豐富發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵茶葉水溶液及茶飲料風(fēng)味影響的風(fēng)味基礎(chǔ),同時(shí)為通過菌種優(yōu)化而調(diào)控發(fā)酵紅茶飲料的風(fēng)味質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。
紅茶葉 莆田市天林茶葉有限公司;正構(gòu)烷烴(C8~C20)、環(huán)己酮(1 g/mL)、β-月桂烯、順式-3-乙烯醇、1-乙基吡咯、芳樟醇氧化物和順-3-己烯基丁酸酯美國(guó)Sigma-Aldrich公司;無水乙醇(優(yōu)級(jí)純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蔗糖(食品級(jí)) 廈門古龍食品有限公司;釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(食品級(jí))安琪酵母股份有限公司;果醋醋桿菌(Acetobacter acetigenoideum)(食品級(jí)) 煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司;植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(食品級(jí)) 山東中科嘉億生物工程有限公司。
QP-2010 Plus GC-MS儀 日本島津公司;Rtx-5MS毛細(xì)管色譜柱(60 mm×0.32 mm,0.25 μm)美國(guó)Restek公司;HH-157330-U手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、75 μm CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。
1.3.1 發(fā)酵紅茶水溶液的制備
按茶水比1∶100(g/mL),90 ℃沖泡3 min。制備1 500 mL紅茶水溶液,沖泡過程中用保鮮膜封口。沖泡完成后,冷卻到室溫,過濾茶渣得到紅茶水溶液。接著加入7%的蔗糖,將紅茶水溶液分裝成每瓶為150 mL。將調(diào)配好紅茶水溶液在沸水浴中,滅菌15 min,并將其迅速冷卻至30 ℃。滅菌中用12 層紗布包住。取其中的3 瓶紅茶水溶液,分別向其加入0.1%酵母菌、0.1%醋酸菌、0.1%乳酸菌,于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)3 d。每種菌種做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后,立即放入冰箱中冷藏。以原紅茶水溶液作為空白對(duì)照樣品。
1.3.2 發(fā)酵紅茶水溶液香氣輪廓的分析
發(fā)酵完成后,根據(jù)ISO 8589標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)方法建立紅茶發(fā)酵液氣味特征感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表(表1),配制一系列不同濃度的香氣標(biāo)準(zhǔn)品。選擇10 名感官評(píng)價(jià)人員(具有3 個(gè)月以上感官評(píng)價(jià)的經(jīng)驗(yàn))包括5 名女性和5 名男性,對(duì)紅茶發(fā)酵液及原紅茶水溶液進(jìn)行感官評(píng)價(jià),其中1 分表示香氣強(qiáng)度較低,4 分表示香氣強(qiáng)度中等,9 分表示香氣強(qiáng)度較高。評(píng)價(jià)過程中,室溫保持(25±2)℃,相對(duì)濕度在50%~75%之間,室內(nèi)無其他氣體干擾并保持通風(fēng)。
表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣體特征與強(qiáng)度Table 1 Aroma characteristics and strength of volatile standard solutions μg/L
1.3.3 發(fā)酵紅茶水溶液揮發(fā)性成分的定性分析
準(zhǔn)確量取10 mL樣液置于50 mL萃取瓶中,再加入20 mL的超純水和10 μL的內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮,混勻之后將萃取瓶放入40 ℃水浴鍋中平衡1 h,最后將老化后的固相微萃取頭插入萃取瓶中吸附20 min。
色譜條件:色譜柱為Rtx-5MS(60 m×0.32 mm,0.25 μm),用高純氦氣(純度99.999%)作為載氣,柱流量為3 mL/min,不分流進(jìn)樣。升溫程序:程序升溫,進(jìn)樣口溫度為230 ℃;初溫度為50 ℃并保持5 min,以3 ℃/min升溫至200 ℃,在200 ℃保持1 min。
質(zhì)譜條件:離子源溫度為200 ℃,電離方式為電子電離源,電離能量為70 eV,接口溫度為250 ℃,選擇SCAN模式為掃描方式進(jìn)行定性分析,離子碎片的掃描范圍為m/z35~500。溶劑延遲時(shí)間為2.5 min。
定性分析:采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST08、NIST08s、FFNSC1.3)進(jìn)行相似度檢索,計(jì)算樣品中揮發(fā)性成分的保留指數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)以及特征離子碎片等進(jìn)行定性分析,其中保留指數(shù)運(yùn)算參照Kratz和Vandendool的方法。
式中:RI為保留指數(shù);TR為保留時(shí)間;x為待測(cè)組分;n和n+1分別為待測(cè)組分出峰前后相鄰的兩個(gè)正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。
1.3.4 發(fā)酵紅茶水溶液揮發(fā)性成分的定量分析
采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,將已知濃度的內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮和一定含量的待分析樣品混勻后,再對(duì)含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)樣品進(jìn)行色譜分析,根據(jù)待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積,按照式(2)計(jì)算待測(cè)組分在樣品中的含量。
使用Excel 2013對(duì)不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液的揮發(fā)性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,制作感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖、柱狀圖。使用加權(quán)平均法對(duì)香氣輪廓進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用SPSS 22.0對(duì)不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液的揮發(fā)性成分進(jìn)行顯著性分析。
圖1 不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.1 Sensory evaluation radar map of black tea infusion fermented by different strains
如圖1所示,酵母菌、醋酸菌、乳酸菌對(duì)紅茶水溶液的花香、甜香、青草香、果香和烘烤香都有顯著影響,其中酵母菌、醋酸菌、乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液后,紅茶水溶液的果香顯著增加,而花香、甜香和青草香降低;此外,用酵母菌、乳酸菌發(fā)酵可顯著降低烘烤香,而醋酸菌卻顯著增加了紅茶水溶液的烘烤香。有研究表明乳酸菌發(fā)酵果蔬汁增加了果香味[23];Mukisa等[24]采用酵母菌和乳酸菌生產(chǎn)高粱發(fā)酵飲料,果香顯著增加;Tu Chunhai等[25]利用紅茶菌發(fā)酵大豆乳清,產(chǎn)生了新的芳香活性物質(zhì),使大豆乳清具有果香味。該結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)相似。
進(jìn)一步分析表明(圖2),乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液的可接受程度最高,通過加權(quán)平均法,以及與3 種菌種發(fā)酵紅茶水溶液的香氣輪廓結(jié)合進(jìn)行分析,其分值為6.3。加權(quán)分析法是指在計(jì)算若干個(gè)數(shù)量的平均數(shù)時(shí),為了考慮每個(gè)數(shù)量在總量中具有的重要性不同,可分別給予不同的權(quán)數(shù),按不同的權(quán)數(shù)計(jì)算所得的各數(shù)量的平均數(shù)[26]。有研究采用加權(quán)平均法表述菌落總數(shù)測(cè)定的數(shù)學(xué)模型[26]。因此,本實(shí)驗(yàn)在一般的加權(quán)平均法的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn),對(duì)花香、甜香、青草香、果香和烘烤香給予不同的權(quán)數(shù),通過式(3)[27]進(jìn)行回歸分析,經(jīng)計(jì)算得出,x1=1.22,x2=0.09,x3=-0.23,x4=0.39,x5=-0.47??芍ㄏ?、甜香和果香對(duì)可接受程度影響為正相關(guān),青草香和烘烤香對(duì)可接受程度影響為負(fù)相關(guān),其中增加果香、甜香和花香,降低青草香和烘烤香是提高紅茶水溶液可接受程度的主要因素。
式中:x1為花香的權(quán)數(shù);x2為甜香的權(quán)數(shù);x3為青草香的權(quán)數(shù);x4為果香的權(quán)數(shù);x5為烘烤香的權(quán)數(shù); 為可接受程度值。
圖2 不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液的可接受程度值Fig.2 Acceptability scores of black tea infusion fermented by different strains
如圖3和表2所示,共鑒定出73 種揮發(fā)性成分,包括酯類23 種,醇類18 種,醛類8 種,烯烴類6 種,酮類7 種,酸類5 種和其他6 種。原紅茶水溶液中共鑒定出30 種揮發(fā)性成分,包括醇類8 種,烯烴類6 種,醛類8 種,酯類4 種,酮類1 種和其他3 種,由此可知其主要揮發(fā)性成分為醇類、烯烴類和醛類。盧艷等[28]將GC-MS采集的質(zhì)譜圖與NIST 08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫進(jìn)行對(duì)照,并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)比,進(jìn)行定性,表明正山小種中的香氣成分有醇類、醛類、酮類和酯類等,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的差異,其可能是原料及測(cè)定方法不同等原因。酵母菌發(fā)酵紅茶水溶液中共鑒定出46 種揮發(fā)性成分,其中醇類13 種,酯類18 種,酸類5 種,烯類3 種,醛類3 種,酮類3 種和其他1 種,由此可知其主要揮發(fā)性成分為醇類和酯類。鄒聰麗[29]采用質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索進(jìn)行定性分析,研究表明酵母菌發(fā)酵紅茶水溶液后主要香氣成分由醇類和醛類變?yōu)榇碱愇镔|(zhì)和酯類物質(zhì),呈現(xiàn)出顯著的酒香味和果香味,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。醋酸菌發(fā)酵紅茶水溶液中共鑒定出33 種揮發(fā)性成分,其中醇類16 種,醛類5 種,酯類3 種,烯類2 種,酸類1 種,酮類3 種和其他3 種,由此可知其主要揮發(fā)性成分為醇類和醛類。張義杰等[30]通過Nist 08數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析,研究表明醋酸菌發(fā)酵西瓜汁的主要揮發(fā)性成分為醇類、酯類、醛類和酸類,果香味顯著增加,也具有青草香、花香和甜香,和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液中共鑒定出32 種揮發(fā)性成分,醇類11 種,醛類7 種,酯類6 種,酮類4 種,烯類2 種和其他2 種,由此可知其主要揮發(fā)性成分為醇類、酯類、醛類和酮類。劉佳奇等[31]通過Agilent Mass Hunter進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析,并通過Central Authentication Service(CAS號(hào))及配比度進(jìn)行定性,研究表明植物乳桿菌發(fā)酵紅茶水溶液得到的香氣成分主要有醇類和酮類,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。
圖3 不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液中揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.3 Total ion flow chromatograms of volatile components in black tea infusion fermented by different strains
表2 不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液中揮發(fā)性化合物的定性結(jié)果Table 2 Qualitative results of volatile compounds in black tea infusion fermented by different strains
續(xù)表2
如表3所示,酵母菌、醋酸菌、乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液產(chǎn)生的揮發(fā)性成分的種類和含量有所差異,與原紅茶水溶液相比,增加了一些揮發(fā)性成分。原紅茶水溶液的揮發(fā)性成分為醇類(60.13 μg/L)、酯類(35.81 μg/L)、酮類(6.22 μg/L)、醛類(115.13 μg/L)、烯烴類(239.56 μg/L)和其他(40.40 μg/L),其含量較高為順式-3-己烯醇(21.07 μg/L)、苯甲醛(39.61 μg/L)、壬醛(24.51 μg/L)、檸檬烯(178.42 μg/L)、萜品烯(28.36 μg/L),其中苯甲醇、香葉醇、苯乙醇、水楊酸甲酯、糠醛是其主要的香氣物質(zhì)[28],糠醛具有烘烤香和甜香[34],苯甲醛具有焦糖香[34],苯甲醇具有花香和甜香[34],檸檬稀具有青草香[35]和果香[36],苯乙醇具有花香和甜香[34],順式-3-己烯醇具有青草香[34],這些物質(zhì)的香氣特征和實(shí)驗(yàn)結(jié)果感官檢驗(yàn)的紅茶香氣特征一致。
酵母菌發(fā)酵紅茶水溶液產(chǎn)生的揮發(fā)性成分最多,增加了醇類物質(zhì)(1 605.93 μg/L)、酯類物質(zhì)(7 715.82 μg/L)和酸類物質(zhì)(596.15 μg/L),降低了醛類物質(zhì)(69.48 μg/L),且酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)含量最高,對(duì)氣味特征貢獻(xiàn)較大。其中紅茶的主體香氣成分苯乙醇、水楊酸甲酯的含量顯著增加,增加了紅茶的主體香味,己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和辛酸是果酒中的主要香氣成分[37]。如圖4所示,酵母菌發(fā)酵紅茶水溶液中酯類物質(zhì)占揮發(fā)性成分的73%,顯著增加;與原茶水溶液以及醋酸菌和乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液相比,酸類物質(zhì)含量較高,而其他物質(zhì)含量顯著降低,因此,果香顯著增加,而花香、青草香、甜香和烘烤香顯著降低。這也是酵母菌發(fā)酵紅茶水溶液可接受程度低于乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液的主要原因。
醋酸菌發(fā)酵紅茶水溶液增加了醇類物質(zhì)(178.33 μg/L)和酮類物質(zhì)(14.15 μg/L),降低了烯烴類物質(zhì)(19.37 μg/L),其酯類物質(zhì)和醛類物質(zhì)含量最高,對(duì)氣味特征貢獻(xiàn)較大。如圖4所示,醇類物質(zhì)和醛類物質(zhì)相對(duì)含量高達(dá)67%,與酵母菌和乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液相比,酯類物質(zhì)含量降低,與原紅茶水溶液相比,酯類物質(zhì)含量增加;烯烴類物質(zhì)與原紅茶水溶液相比顯著降低;酮類物質(zhì)與乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液相比顯著降低。苯乙醇具有烘烤香,壬醛具有油脂香,順式-3-己烯醇具有木香和蘑菇香[38],香葉醇具有花香,且醇類物質(zhì)具有果香[39],檸檬烯具有青草香,其含量顯著降低。因此,這些成分變化與醋酸菌增加紅茶水溶液的烘烤香和果香,降低了花香、青草香和甜香的結(jié)果一致,也使其可接受程度最低。
乳酸菌發(fā)酵后,紅茶水溶液增加了醇類物質(zhì)(90.70 μg/L)、酯類物質(zhì)(53.91 μg/L)和酮類物質(zhì)(19.82 μg/L),降低了烯烴類物質(zhì)(10.89 μg/L)。劉佳奇等[31]研究表明植物乳桿菌發(fā)酵紅茶水溶液得到的香氣成分主要有醇類物質(zhì)和酮類物質(zhì),與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。其中產(chǎn)生的新物質(zhì)中,肉桂酸乙酯具有淡的甜蜂蜜香味和肉桂香味,十一酮具有桃子香[31],酯類和高級(jí)醇具有果香[39],總相對(duì)含量為53%;此外,檸檬烯含量和苯甲醛含量降低,苯甲醛具有花香和甜香,檸檬烯具有青草香。如圖4所示,酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)總相對(duì)含量為86%,與原紅茶水溶液以及酵母菌和醋酸菌發(fā)酵紅茶水溶液相比,醇類物質(zhì)、酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)都顯著增加;而與原紅茶水溶液和醋酸菌發(fā)酵紅茶水溶液相比,酯類物質(zhì)顯著增加;烯烴類物質(zhì)與原紅茶水溶液相比顯著降低。因而,乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液果香增加,且降低花香、青草香、甜香和烘烤香的結(jié)果與這些成分變化的規(guī)律一致。根據(jù)感官評(píng)價(jià)得知,增加果香、甜香和花香,降低青草香和烘烤香是提高紅茶水溶液可接受程度的主要因素。乳酸菌發(fā)酵紅茶水溶液后,與酵母菌和醋酸菌發(fā)酵紅茶水溶液相比,花香和甜香的降低程度小,其與原紅茶水溶液較為接近。且果香增加,烘烤香減低,因此其可接受程度最高。
表3 不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液中揮發(fā)性化合物的定量結(jié)果Table 3 Quantitative results of volatile components in black tea infusion fermented by different strains
續(xù)表3
圖4 不同菌種發(fā)酵紅茶水溶液的揮發(fā)性成分含量差異圖Fig.4 Comparison of concentrations of various classes of volatile components in black tea infusion fermented by different strains
香氣輪廓分析表明,酵母菌發(fā)酵可顯著增加紅茶水溶液果香,并降低花香、青草香、甜香和烘烤香;醋酸菌發(fā)酵可增加紅茶水溶液烘烤香和果香,并降低花香、青草香和甜香;乳酸菌發(fā)酵可增加紅茶水溶液果香,降低花香、甜香、青草香和烘烤香。香氣接受程度綜合分析表明,乳酸菌發(fā)酵后紅茶水溶液的香氣可接受程度最高,而醋酸菌和乳酸菌發(fā)酵會(huì)降低紅茶水溶液的香氣可接受程度。加權(quán)平均法進(jìn)行分析表明,紅茶水溶液的香氣可接受程度的增加與果香、甜香和花香增加及青草香和烘烤香降低密切相關(guān)。GC-MS分析表明酵母菌發(fā)酵后紅茶水溶液香氣接受程度的提高與醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)和酸類物質(zhì)增加及醛類物質(zhì)降低有關(guān);醋酸菌發(fā)酵后紅茶水溶液香氣的變化與醇類物質(zhì)和酮類物質(zhì)增加及烯烴類物質(zhì)降低有關(guān);乳酸菌發(fā)酵后紅茶水溶液香氣改變與醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)和酮類物質(zhì)含量增加及烯烴類物質(zhì)減少有關(guān)。該研究為提高紅茶的產(chǎn)品風(fēng)味提供了研究參考。