唐 標(biāo)，羅 怡，李 銳，周秀楠，張 玲,，錢鳴蓉，戴賢君，夏效東，楊 華,

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

蜂花粉是蜜蜂從植物中采集花蜜后加入自身腺上分泌物和唾液后制成的呈扁圓形的團(tuán)狀物，是蜜蜂蜂群主要的蛋白質(zhì)來源[1]。蜂花粉具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，包含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類以及酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等多種生物活性物質(zhì)，被譽(yù)為“微型營(yíng)養(yǎng)庫”[2-3]。蜂花粉中多酚類和黃酮類物質(zhì)廣泛存在，被認(rèn)為是有效的抗氧化劑[4-7]。蜂花粉具有抗動(dòng)脈粥樣硬化活性[8]和抗菌活性[9-10]，對(duì)心臟病、高血壓、高血脂、高血糖等心腦血管疾病具有很好的預(yù)防和改善作用，可調(diào)節(jié)人體免疫能力和神經(jīng)系統(tǒng)。因此蜂花粉作為天然營(yíng)養(yǎng)保健品，其生物活性相關(guān)研究一直受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者關(guān)注，也是蜂花粉產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用的重要因素[11-13]。

蜂花粉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，但在加工生產(chǎn)過程中，存在粗放加工現(xiàn)象，可能造成蜂花粉產(chǎn)品受到微生物二次污染，進(jìn)而導(dǎo)致蜂花粉產(chǎn)品質(zhì)量的下降，甚至危害消費(fèi)者健康。此外，作為蜜蜂的重要營(yíng)養(yǎng)來源，蜂花粉中大量微生物的存在會(huì)危害蜜蜂的生長(zhǎng)繁殖，可能影響蜂群的生產(chǎn)能力，降低蜂產(chǎn)品的質(zhì)量，危害蜂農(nóng)的利益[14]。

蜂花粉產(chǎn)品的生產(chǎn)量及銷售量日益增長(zhǎng)，但關(guān)于蜂花粉產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈微生物污染狀況的相關(guān)報(bào)道仍較少[15-17]。本研究收集了浙江省主要蜂花粉產(chǎn)區(qū)的代表性蜂花粉產(chǎn)品，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蜂花粉產(chǎn)品中細(xì)菌和真菌菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并使用16S rDNA和ITS擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)茶花粉和荷花粉的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及真菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析討論。本研究旨在較為準(zhǔn)確地評(píng)估蜂花粉產(chǎn)品的微生物污染狀況，提升蜂花粉產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

在浙江省龍游、長(zhǎng)興、蘭溪、江山、武義、寧波等市縣共采集107 個(gè)蜂花粉樣品，養(yǎng)蜂場(chǎng)購(gòu)買59 份，其中17 份為現(xiàn)場(chǎng)新鮮采集；市場(chǎng)購(gòu)買50 瓶。蜂花粉類型包括油菜花粉（44 份）、茶花粉（31 份）、荷花粉（11 份）、雜花粉（7 份）、伍倍子花粉（4 份）、蕎麥粉（3 份）、野玫瑰花粉（3 份）、益母草粉（3 份）、葵花粉（1 份）。

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Gel Doc凝膠成像系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；MP FastPrep-24組織研磨儀 美國(guó)MP生物醫(yī)療公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5424R微量高速離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；Nanodrop ONE核酸定量?jī)x 賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司；SW-CJ-ICU超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離

稱取5 g蜂花粉樣品分別按GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》和GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌酵母總數(shù)的測(cè)定。

1.3.2 含水量檢測(cè)

稱取2～5 g蜂花粉樣品，按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中干燥法對(duì)水分含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 16 S rDNA及ITS擴(kuò)增子測(cè)序

DNA抽提使用試劑盒PowerSoil DNA Isolation Kit方法進(jìn)行抽提，濃度使用Nanodrop進(jìn)行定量，同時(shí)通過凝膠電泳檢測(cè)。細(xì)菌的16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。真菌的ITS擴(kuò)增子測(cè)序選用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。擴(kuò)增子測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina MiSeq平臺(tái)，PE reads的質(zhì)控、OTU聚類分析、α多樣性和β多樣性等分析使用I-Sanger云平臺(tái)（https://www.i-sanger.com/）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)涉及的統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)圖形繪制使用GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉的含水量

圖1 107 份蜂花粉的水分含量Fig.1 Water contents of 107 bee pollen samples

如圖1所示，107 份蜂花粉總體的含水量在8.06%～32.92%之間。17 份在蜂場(chǎng)當(dāng)天收集的新鮮蜂花粉的含水量較高，在18.92%～32.92%之間，42 份經(jīng)過1～2 d晾曬后的蜂花粉含水量分布為8.06%～15.87%。在市場(chǎng)上流通的蜂花粉含水量主要集中在9.42%～16.86%之間。

2.2 微生物污染分析

圖2 蜂花粉的細(xì)菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)Fig.2 Bacterial and fungal colony counts of bee pollen

如圖2所示，有8 個(gè)樣品未培養(yǎng)出可見克隆，其中兩個(gè)樣品菌落總數(shù)在2.5×105CFU/g以上，其他樣品在5×101～2.7×104CFU/g區(qū)間范圍。霉菌總數(shù)只有2 個(gè)樣品未培養(yǎng)出可見的克隆，其中兩個(gè)樣品的菌落總數(shù)在2.7×105CFU/g以上，其他樣品在5×101～6.5×104CFU/g區(qū)間范圍。從圖2A可以看出，蜂花粉中的真菌菌落總數(shù)相比細(xì)菌菌落總數(shù)較大，并且差異有顯著性。由于真菌可見培養(yǎng)的菌落絕大多數(shù)是霉菌，說明蜂花粉被污染霉菌的風(fēng)險(xiǎn)較細(xì)菌更高。

59 份在蜂場(chǎng)購(gòu)買的蜂花粉（含水量高于18.92%的樣品17 份與晾曬后的樣品42 份）的菌落總數(shù)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，低含水量的蜂花粉無論是在細(xì)菌菌落總數(shù)（圖2B）上還是真菌菌落總數(shù)（圖2C）都高于高含水量的蜂花粉，差異具有顯著性。高含水量（＞18%）的蜂花粉較新鮮，直接從蜂箱外采集，可以基本排除后期加工貯運(yùn)的污染；低含水量（＜17%）的蜂花粉通過晾曬、貯運(yùn)等環(huán)節(jié)，增加了霉菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

對(duì)零售市場(chǎng)上購(gòu)買的商品化的7 份荷花粉和5 份茶花粉樣品進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序，其中1 份測(cè)序獲得reads數(shù)明顯偏低，數(shù)值沒有加入分析。根據(jù)稀釋曲線可知11 個(gè)樣本獲得的reads數(shù)量飽和（圖3A），并進(jìn)行了細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析。聚類分析后，共獲得663 個(gè)無冗余的分類單元（operational taxonomic unit，OTU），可確定具有明確分類地位的屬208 個(gè)。從圖3可以看出，茶花粉與荷花粉細(xì)菌菌群多樣性結(jié)構(gòu)無顯著性差異。從科水平統(tǒng)計(jì)，藍(lán)細(xì)菌和腸桿菌占比例最大。在屬水平上，主要的細(xì)菌污染源為藍(lán)細(xì)菌、腸桿菌科類細(xì)菌及乳桿菌，其中乳桿菌也廣泛存在于蜜蜂的腸道中[18-19]。另外，可以發(fā)現(xiàn)茶花粉相比荷花粉，含有的莫拉氏菌科的細(xì)菌更豐富。該科的細(xì)菌有部分是條件致病菌，茶花粉中更豐富的原因可能是與茶花的生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)，或者是采集茶花特殊的蜂群腸道中含有該類菌，在蜜蜂加工的過程中傳播到蜂花粉中。

圖3 荷花粉和茶花粉細(xì)菌菌群多樣性分析Fig.3 Diversity analysis of bacterial communities in lotus and camellia bee pollens

2.4 真菌菌落組成分析

對(duì)以上同樣的7 份茶花粉與5 份荷花粉抽提的DNA進(jìn)行ITS擴(kuò)增子測(cè)序，根據(jù)稀釋曲線可知測(cè)序深度已經(jīng)飽和（圖4A）。聚類分析后共獲得1 171 個(gè)無冗余OTU，可以明確分類地位的共有263 個(gè)屬。根據(jù)α多樣性分析可以發(fā)現(xiàn)真菌菌群多樣性要高于細(xì)菌。同時(shí)，兩類樣品真菌菌群組成差異極顯著，茶花粉的真菌多樣性高于荷花粉（圖4B）。

在屬水平上，unclassified_f_Davidiellaceae（未確定分類地位的，歸屬于小戴衛(wèi)霉科）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）、鐮孢菌屬（Fusarium）占比例較高（圖4C）。曲霉屬、青霉菌屬、鐮孢菌屬是產(chǎn)生真菌毒素的常見菌[20]。曲霉屬可產(chǎn)生黃曲霉毒素，以黃曲霉為代表，是產(chǎn)生黃曲霉毒素的主要菌種[21]，同樣在預(yù)測(cè)的OTU中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉菌。另外，鐮孢菌屬可產(chǎn)生鐮刀菌素和伏馬毒素，青霉菌屬可以產(chǎn)生橘霉素[20]。盡管預(yù)測(cè)到了該類菌，有產(chǎn)生毒素的風(fēng)險(xiǎn)，但是并不說明蜂花粉污染的霉菌能夠產(chǎn)生毒素；即使產(chǎn)生微量毒素，也未必能夠達(dá)到相應(yīng)的檢出限。

圖4 荷花粉和茶花粉的真菌菌群多樣性分析Fig.4 Diversity analysis of fungal communities in lotus and camellia bee pollens

圖5 荷花粉和茶花粉的真菌菌群在屬水平上的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)Fig.5 Wilcoxon rank-sum test plots of fungal community structures of lotus and camellia bee pollens at the genus level

從圖5可以看出，unclassified_f_Davidiellaceae、unclassified_p_Ascomycota、unclassified_o_Hypocreales、Zymoseptoria在茶花粉中相比在荷花粉中含量較高，差異具有顯著性；其中Zymoseptoria含量在兩者之間具有極顯著差異，Zymoseptoria同時(shí)也是重要的植物致病菌[22-23]。Wallemia、Aspergillus、Russula在荷花粉中相比茶花粉含量高，差異具有顯著性。從屬水平主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）看，這兩種花粉的真菌菌群結(jié)構(gòu)也可明顯分成兩個(gè)區(qū)域（圖6）。這些真菌的菌群差異可能是花粉來自不同的植物，與植物本身的易感真菌、生長(zhǎng)環(huán)境（空氣、土壤、水）及后期加工運(yùn)輸過程的污染等因素相關(guān)。

圖6 荷花粉和茶花粉的真菌菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上的PCoAFig.6 PCoA plot of fungal community structures of lotus and camellia bee pollen at the genus level

3 討 論

蜂花粉可以作為蜂糧，影響蜜蜂的腸道微生物[24-25]。蜜蜂對(duì)其利用會(huì)顯著提高消化道細(xì)菌總數(shù)和特異性豐度，刺激對(duì)蜜蜂有毒的糖（木糖、阿拉伯糖、甘露糖）的水解，同時(shí)產(chǎn)生的糖苷水解酶與蜜蜂自身和花粉中存在的酶有協(xié)同作用[26]。同時(shí)蜂花粉作為保健品，關(guān)系到食品安全，直接影響人的健康。蜂花粉相比蜂蜜、蜂王漿等產(chǎn)品重視程度較低，蜂花粉的藥物殘留分析研究相對(duì)較多[27-29]，但微生物污染研究極少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)浙江省采集的蜂花粉從上游養(yǎng)蜂場(chǎng)到零售環(huán)節(jié)均有涉及，對(duì)可培養(yǎng)的微生物污染進(jìn)行了分析，對(duì)茶花粉及荷花粉的細(xì)菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，最后對(duì)于蜂花粉的污染概況具有了初步認(rèn)識(shí)。

從研究結(jié)果看，蜂花粉的細(xì)菌污染水平小，菌群多樣性水平低，沒有發(fā)現(xiàn)常見的病原菌，例如沙門氏菌、克雷伯菌、金黃色葡萄球菌等；霉菌污染相對(duì)細(xì)菌嚴(yán)重，真菌菌群多樣性相對(duì)細(xì)菌較高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生真菌毒素的真菌含量豐富，具有食品安全風(fēng)險(xiǎn)。通過對(duì)茶花粉與荷花粉細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著，其中藍(lán)細(xì)菌、腸桿菌科、乳桿菌含量高。據(jù)報(bào)道，乳酸菌同樣是蜜蜂腸道的主要菌群之一[30-31]。

茶花粉與荷花粉的真菌菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，unclassified_f_Davidiellaceae、unclassified_p_Ascomycota、unclassified_o_Hypocreales、Zymoseptoria在茶花粉中相比在荷花粉中含量高，差異顯著；Wallemia、Aspergillus、Russula在荷花粉中相比茶花粉含量高，具有顯著性差異。盡管預(yù)測(cè)了蜂花粉中存在產(chǎn)生真菌毒素的種屬，具有真菌毒素感染的風(fēng)險(xiǎn)，但需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證是否能夠檢出相應(yīng)的毒素，或者毒素含量達(dá)不到檢出限。

蜂花粉的菌群多樣性或結(jié)構(gòu)較其他樣品（如糞便、土壤、河流樣品）簡(jiǎn)單[32-35]。已有研究報(bào)道，花粉的來源影響蜂房和蜜蜂幼蟲的微生物組成[19,36-37]。蜂花粉中的微生物來源可能來源包括蜜蜂腸道菌[31]、植物花粉源微生物[38]、生長(zhǎng)環(huán)境微生物[39]以及加工貯運(yùn)環(huán)節(jié)污染的微生物，對(duì)于如何對(duì)含有的微生物溯源仍需進(jìn)一步深入研究。蜂花粉類型較多，其微生物組成容易受到采集環(huán)境、貯運(yùn)環(huán)節(jié)影響，單一的研究無法準(zhǔn)確全面反映蜂花粉的污染。本實(shí)驗(yàn)側(cè)重了蜂花粉中可培養(yǎng)微生物的菌落總數(shù)檢測(cè)，并作了茶花粉和荷花粉的菌群分析與比較。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從107 份蜂花粉中測(cè)定菌落總數(shù)和含水量，對(duì)荷花粉和茶花粉進(jìn)行真菌與細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)新鮮的蜂花粉含水量高于18%，但是微生物污染水平較低。以荷花粉和茶花粉為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)蜂花粉的細(xì)菌菌群中藍(lán)細(xì)菌、腸桿菌科類細(xì)菌及乳桿菌較多，而真菌菌群Davidiellaceae、曲霉屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）和鐮孢菌屬（Fusarium）占比例較高。荷花粉與茶花粉的真菌菌群多樣性差異顯著。總體來看，蜂花粉真菌菌群多樣性高，可以產(chǎn)真菌毒素的霉菌豐富，具有食品安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究可為蜂花粉的安全評(píng)價(jià)提供依據(jù)。