袁妙賢，尹強，季春宜，謝惟心

（湖南省兒童醫(yī)院 普外一科，湖南 長沙 410007）

肝母細(xì)胞瘤（hepatoblastoma，HB）是一種來源于肝臟母細(xì)胞的胚胎性腫瘤，兒童期最為常見，約占肝臟原發(fā)性腫瘤的60%，發(fā)病率位于兒科腹部實體腫瘤第3位，且呈逐年上升趨勢[1-2]。盡管近年來手術(shù)和化療手段在HB治療中取得了良好療效，但由于存在化療藥物的細(xì)胞毒性以及手術(shù)的高風(fēng)險性，患者整體臨床預(yù)后仍然較差[3]。腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移仍是影響HB預(yù)后的重要因素，而腫瘤生長與轉(zhuǎn)移是一個依賴于血管的過程，因此，研究HB的血管生成及針對其血管生成的治療對提高HB的治療效果、改善預(yù)后具有重要意義。

近年來，長鏈非編碼RNA（lncRNA）的表達(dá)異?；蚬δ苁д{(diào)與惡性腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)，HB組織中有多個調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的lncRNA表達(dá)異常，并且可能在HB 的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。有研究顯示，lncRNA TUG1對目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳學(xué)等多種生物學(xué)功能具有調(diào)控作用，其異常表達(dá)能夠參與肺癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，提示TUG1作為關(guān)鍵的腫瘤病理學(xué)調(diào)控分子，有望為腫瘤治療提供潛在靶點[4-7]。但目前TUG1對HB發(fā)生發(fā)展的影響及作用機制尚不明確。本研究觀察了HB組織中l(wèi)ncRNA牛磺酸上調(diào)基因1（TUG1）、血管生成有關(guān)的JAK2-STAT3通路信號分子及該通路上游的微小RNA（miRNA）與下游的相關(guān)效應(yīng)分子的表達(dá)，并結(jié)合細(xì)胞實驗初步分析它們之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究中60例HB 患兒的腫瘤組織及其遠(yuǎn)端瘤旁正常組織來自湖南省兒童醫(yī)院手術(shù)患者。其中，男25例，女35例；年齡2個月至11歲，平均4.7歲；病理類型：胚胎型7例，互變型12例，混合型41例。研究正式開展前獲本院倫理委員會批準(zhǔn)。

人肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫；RPMA-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液和脫脂奶粉購自西安科昊生物公司；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；引物、siRNA以及慢病毒過表達(dá)載體購自上海吉瑪生物公司；qRTPCR試劑購自Takara生物公司；JAK2-STAT3信號通路蛋白及血管生成相關(guān)蛋白VEGF、VEGFR2、HIF-1α和GAPDH抗體分別購自英國Abcam和美國Cell Signaling Technology生物公司；辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記的二抗購自武漢博士德生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化染色方法將HB 組織及其遠(yuǎn)端瘤旁正常組織樣本進(jìn)行石蠟包埋，切片后采用二甲苯脫蠟以及梯度乙醇水化；隨后將切片置于3% 甲醇-H2O2孵育后轉(zhuǎn)入0.01 mol/L 枸櫞酸鈉鹽溶液進(jìn)行抗原修復(fù)；加入5% 的胎牛血清室溫封閉后分別加入一抗和二抗孵育，采用DAB 顯色，于顯微鏡下觀察顯色情況，并采用中性樹膠封片。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用含10% FBS 和1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時以6×105個/2 mL/ 孔細(xì)胞密度接種于6 孔板培養(yǎng)過夜，次日分別轉(zhuǎn)染TUG1 抑制物及miR-204 模擬物繼續(xù)培養(yǎng)24 h（qRT-PCR）或48 h（Western blot），檢測轉(zhuǎn)染效率。同時，設(shè)立轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞為陰性對照組。

1.2.3 qRT-PCR 方法采用TRIzol 裂解液提取所獲HB 組織及其遠(yuǎn)端瘤旁正常組織樣本與HepG2 細(xì)胞樣本的總RNA，并用Epoch 紫外分光光度計檢測總RNA 濃度；隨后采用Takara 公司5×PrimeScript RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，以Takara 公司2×SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒實時定量PCR 檢測上述不同組織及細(xì)胞樣本中Lnc TUG1、miR-204、JAK2-STAT3 信號通路蛋白及血管生成相關(guān)蛋白VEGF、VEGFR2、HIF-1α 的總RNA 表達(dá)情況，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，qRT-PCR 引物序列如表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.4 Western blot 方法采用RIPA 裂解液提取HB 組織及其遠(yuǎn)端瘤旁正常組織樣本與HepG2 細(xì)胞樣本的總蛋白，并進(jìn)行BCA 蛋白定量；取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜。裁剪目的蛋白條帶并采用5% 脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h。分別與適度稀釋的JAK2-STAT3 信號通路蛋白及血管生成相關(guān)蛋白VEGF、VEGFR2、HIF-1α 和GAPDH 單克隆抗體4 ℃孵育過夜。次日，PBST洗滌目的蛋白條帶，加入HRP 標(biāo)記抗人源IgG 二抗室溫孵育2 h。PBST 洗滌3 次后進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光檢測，并記錄蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行組間對比， 相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，HB 腫瘤組織中J A K 2和STAT3呈明顯陽性表達(dá)。JAK2在HB組織及癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為40.1%與16.9%，STAT3在HB組織及瘤旁正常組中的陽性表達(dá)率分別為55.7%與19.8%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 qRT-PCR 結(jié)果

圖1 免疫組化檢測JAK2 與STAT3 蛋白表達(dá)（×100）Figure 1 Immunohistochemical staining for JAK2 and STAT3 protein expressions (×100)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與遠(yuǎn)端瘤旁正常組織比較，HB組織中TUG1、JAK2、STAT3及血管生成相關(guān)分子VEGF、VEGFR2、HIF-1α的RNA表達(dá)明顯上調(diào)，miR-204明顯降低（均P＜0.05）。TUG1敲減及miR-204過表達(dá)均能明顯抑制HepG2細(xì)胞中JAK2-STAT3及血管生成相關(guān)分子VEGF、VEGFR2、HIF-1α 的RNA表達(dá)（均P ＜0.05）（圖2）。

圖2 qRT-PCR 檢測結(jié)果 A：組織樣本；B：HepG2 細(xì)胞Figure 2 Results of qRT-PCR A: Tissue samples; B: HepG2 cells

2.3 TUG1 與miR-204 在HB 組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HB患兒腫瘤組織內(nèi)TUG1與miR-204的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.962，P=0.014）。

2.4 Western blot 結(jié)果

Westernblot 檢測結(jié)果示，與遠(yuǎn)端瘤旁正常組織比較，HB 患兒腫瘤組織樣本中JAK 2-STAT3通路相關(guān)分子及血管生成相關(guān)分子VEGF、VEGFR2、HIF-1α的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（均P＜0.05）。此外，TUG1敲減及miR-204過表達(dá)均能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞中JAK2-STAT3及血管生成相關(guān)分子VEGF、VEGFR2、HIF-1α的蛋白表達(dá)（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 Western blot 檢測結(jié)果 A：組織樣本；B：HepG2 細(xì)胞Figure 3 Results of Western blot A: Tissue samples; B: HepG2 cells

3 討 論

近年來，盡管手術(shù)和化療手段在HB 治療中取得一定療效，但較高的手術(shù)風(fēng)險和化療藥物的毒性反應(yīng)仍然制約著HB的臨床治療效果[8-14]。因此，闡明HB的發(fā)病機制是改善臨床診療及防治HB的重要條件。

腫瘤血管的生成過程較為復(fù)雜，主要包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化形成血管環(huán)、產(chǎn)生新的基底膜等步驟，腫瘤血管的生成多源于原生血管，并向瘤體不斷輸送營養(yǎng)成分[15-17]。惡性腫瘤的血管生成過程受血管內(nèi)皮生成因子VEGF的調(diào)節(jié)，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖進(jìn)而生成新的血管，充足的營養(yǎng)供給將加速腫瘤的進(jìn)展。因此，腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[18]。有學(xué)者[19]在HB的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，患兒瘤體中VEGF水平出現(xiàn)差異性高表達(dá)，且微血管密度提高，具有較強的新血管生成特征，導(dǎo)致HB生長迅速，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，預(yù)后差等。

通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)，HB 組織中多個調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的lncRNA表達(dá)異常。其中，lncRNA CRNDE可通過調(diào)控mTOR信號通路激活靶蛋白發(fā)揮抑制HB增殖和血管生成的作用，提示lncRNA可能成為HB的潛在調(diào)控因子和預(yù)后標(biāo)志物[20-21]。TUG1屬于lncRNA家族重要成員，在多種惡性腫瘤及細(xì)胞系如腦膠質(zhì)瘤、胃癌、食管癌、膀胱癌等腫瘤細(xì)胞中異常過表達(dá)，進(jìn)而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和抗凋亡的作用。因此，TUG1被認(rèn)為是一種原癌基因。此外，蛋白組學(xué)研究[22]亦表明TUG1在HB及其轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)明顯上調(diào)，上調(diào)的TUG1進(jìn)一步誘導(dǎo)瘤體內(nèi)異常血管增生，進(jìn)而增強HB細(xì)胞的增殖和侵襲能力，但TUG1在HB發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制還有待深入探究。

mi RNA是一類長度約22 個核苷酸的非編碼RNA，研究表明其能夠通過誘導(dǎo)沉默復(fù)合體調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的生長、分化、代謝及凋亡等生命過程[23]。而惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的過度表達(dá)和抑癌基因的沉默相關(guān)，在此過程中，JAK2-STAT3信號通路會持續(xù)性激活，使下游原癌基因VEGF和MMP-2等過度表達(dá)，加速腫瘤的進(jìn)展[6]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可以通過JAK2-STAT3途徑減弱肺腺癌中的血管生成，兩者存在潛在的結(jié)合位點[24-27]。因此，筆者推測JAK2-STAT3可能是TUG1介導(dǎo)miR-204發(fā)揮調(diào)控HB腫瘤血管生成的重要通路。

本研究通過對2017年3月—2018年4月收集的HB患兒腫瘤組織及其遠(yuǎn)端瘤旁正常組織中TUG1、miR-204以及JAK2-STAT3的表達(dá)進(jìn)行分析，并通過構(gòu)建TUG1敲減及miR-204過表達(dá)的HepG2細(xì)胞系進(jìn)一步探究TUG1是否通過miR-204介導(dǎo)JAK2-STAT3途徑調(diào)控肝母細(xì)胞瘤血管生成的作用機制，發(fā)現(xiàn)HB患兒腫瘤組織較其遠(yuǎn)端瘤旁正常組織呈現(xiàn)明顯病理損傷，且腫瘤組織中JAK2和STAT3呈明顯陽性表達(dá)。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，相比遠(yuǎn)端瘤旁正常組織，腫瘤組織中TUG1和JAK2-STAT3通路蛋白明顯上調(diào)；細(xì)胞實驗結(jié)果證實TUG1敲減及miR-204過表達(dá)均能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞JAK2-STAT3及血管生成相關(guān)蛋白VEGF、VEGFR2、HIF-1α的表達(dá)。此外，HB患兒腫瘤組織內(nèi)TUG1和miR-204的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.962，P=0.014），提示HB患兒腫瘤組內(nèi)TUG1的異常表達(dá)可能抑制miR-204表達(dá)，從而激活JAK2-STAT3途徑，促進(jìn)HB血管生成。揭示TUG1參與調(diào)控HB血管生成的作用機制和可用于早期檢查和預(yù)測病變程度，有望為臨床治療HB提供新分子靶標(biāo)[28-30]。

綜上所述，TUG1/miR-204/JAK2-STAT3信號軸在HB患者血管生成及發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中可能發(fā)揮著重要調(diào)控作用，通過靶向TUG1/miR-204/JAK2-STAT3信號軸核心調(diào)控分子有望為臨床治療HB提供新的分子靶點和治療思路。