蘇世強，張 晉，杜 泓，陳 延，楊翠霞，李 珅

(1.河北省石家莊市人民醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第980醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050082)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于腎實質的惡性腫瘤，簡稱腎癌。近年來RCC發(fā)病率逐年上升。RCC早期多無癥狀，近年來隨著健康體檢的逐漸普及，其檢出率不斷升高，但仍有近1/3RCC患者在初次就診時腫瘤已經遠處轉移[1]。目前，臨床上尚無便捷有效地評估RCC患者治療預后的生物標記物。斯鈣素( stanniocalcin，STC) 是一類糖蛋白激素，人類STC家族分為STC1和STC2[2]，STC參與機體代謝、炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等病理生理過程，Meyer等[3]研究發(fā)現(xiàn)RCC患者STC2高表達，并與腫瘤侵襲力性及不良預后密切相關，因而認為STC2可以作為判斷腎切除術后RCC患者預后的腫瘤標志物。目前關于外周血清STC1在RCC判斷其預后的文獻鮮有報道。本研究旨在通過檢測RCC患者外周血清中STC1基因和蛋白水平的表達差異，結合RCC患者臨床病理參數(shù)和預后生存情況，初步探討血清中STC1表達異常在判斷RCC患者預后方面的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年6月—2015年6月河北省石家莊市人民醫(yī)院泌尿外科初次行手術且術后病理確診的50例RCC患者(試驗組)。所有患者術前臨床病理及影像資料完整，術后進行規(guī)范的隨訪。50例RCC患者中，男性28例，女性22例；年齡40～79歲，中位年齡55歲。臨床分期按照第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)腎癌分期和2017年TNM分期系統(tǒng)，收集同期正常人群血清50例作為對照組，男性27例，女性23例；年齡41～78歲，中位年齡54歲。2組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者知情同意書并簽署知情同意書。

1.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR) 采集RCC患者術前清晨空腹外周血6 mL(3 mL 提取RNA，3 mL 提取血清)，同時采集健康體檢者清晨空腹外周血6 mL，采用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)抗凝，室溫靜置30 min，2 500 r/min離心10 min，然后吸取上清液備用。凍存在-80 ℃冰箱中。用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取血清中的總RNA，引物合成序列(見表1)按照說明書，經一步RT-PCR試劑盒(全式金，北京)逆轉錄到cDNA上。采用SYBRGreen染料法進行實時定量PCR(ABI 7500，美國應用生物系統(tǒng)公司)。每個樣本設3個復管，目的基因和β-actin基因在同一反應條件下進行，同時設立陰性對照。使用Roto Gene 3000軟件手動操作，計算CT值，以2-△△Ct法計算2組基因表達水平差異[4]。反應體系為：SYBR Green(2X) 10 μL，正向引物0.25 μmol/L，反向引物 0.25 μmol/L，cDNA模板 1 μL，無核酸蒸餾水至20 μL。反應條件：94 ℃ 1 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。

表1 引物合成序列Table 1 Primer synthesis sequence

1.3酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測 采用 ELISA 法檢測血清中 STC1的蛋白含量:參照試劑說明書加樣于反應孔中后37 ℃孵育 1 h，洗板，每微孔先滴入底物Ⅰ 50 μL，再滴入底物Ⅱ 50 μL，混勻，避光反應15 min，然后滴入終止液，每孔50 μL，混勻，使反應終止;30 min 內進行檢測，酶標儀設為450 nm，記錄各微孔的吸光度值(optical density，OD) ，根據(jù)標準曲線的回歸方程式計算 STC1的含量。

1.4資料收集 所有患者術前進行(血細胞分析、生化等檢查)、腹部超聲或CT以及肺部影像學檢查。術后規(guī)范性隨訪每例患者，每3個月回訪并記錄生存狀態(tài)，所有患者中位隨訪時間為59.3 個月。生存分析采用計算患者總生存率(overall survival，OS)，即從患者手術日期到因各種原因而死亡的時間。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用獨立樣本的t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；STC1在腎細胞癌中的預后作用采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線log-rank比較兩組間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.12組外周血清STC1基因(STC1mRAN)表達比較 Real-time PCR結果顯示，試驗組患者外周血清中STC1基因的表達明顯高于對照組(1.203±0.271vs0.353±0.182，t=12.132，P<0.001)。

2.22組外周血清STC1蛋白含量的比較 ELISA結果顯示，RCC患者外周血清中STC1蛋白的表達明顯高于正常人群對照組(23.112±6.054vs12.583±4.592，t=7.792，P<0.001)。

2.3血清STC1基因含量和臨床參數(shù)的關系 進一步對50例RCC患者血清STC1含量和臨床病理參數(shù)等進行了相關性分析，RCC患者血清中STC1mRNA 表達明顯升高，RCC患者腫瘤組織中表達STC1變化在患者有無臨床癥狀、不同F(xiàn)uhrman分級、是否伴壞死、AJCC腎癌分期、淋巴結轉移和是否遠處轉移方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 RCC患者外周血中的STC1mRNA表達與臨床病理學特征關系Table 2 Relationship between STC1 mRNA expression in peripheral blood of renal cell carcinoma patients and the clinical pathological parameters

2.4RCC患者術前血清STC1蛋白表達水平與預后關系 50例RCC患者均獲隨訪，中位隨訪時間為59.3個月，隨訪期間17例患者因各種原因發(fā)生死亡。按外周血清中STC1表達水平的中位數(shù)分為低表達組和高表達組。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，STC1 高表達組患者總體生存明顯差于低表達組患者(P<0.001)，見圖1。

圖1 RCC患者血清STC1蛋白低表達和高表達組術后總體生存曲線

3 討 論

RCC的具體發(fā)病機制尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)RCC發(fā)生與發(fā)展受到多種基因調控，其中涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活和增殖調節(jié)失控等多因素多環(huán)節(jié)，并通過多條信號轉導通路共同起作用。缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors，HIF)在RCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，近年來，學者高度關注一種與HIF-1α密切相關的糖蛋白激素—STC，目前研究證實內源性低氧HIF-1α是缺氧條件下誘導 STC1mRNA 表達增強的一個關鍵因子，STC1通過促進缺氧區(qū)域的血管生成和提高腫瘤細胞的缺氧耐受性，來維持腫瘤細胞的能量代謝、新血管形成及腫瘤增殖[2-5]。Ma 等[6]通過在RCC組織和細胞水平研究發(fā)現(xiàn)缺氧促進 STC1表達。Meyer等[3]研究發(fā)現(xiàn)RCC患者中STC2高表達，而且發(fā)現(xiàn)STC2高表達患者總生存期較短，得出結論STC2可作為RCC患者術后判斷預后的腫瘤標記物。STC1同樣在多種惡性腫瘤患者血清和腫瘤組織中異常表達，樊鑫等[7]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患癌組織中STC1在基因和蛋白水平均表達升高，進一步通過向體外培養(yǎng)膀胱癌細胞中加入外源性STC1蛋白，可見STC1可促進膀胱癌細胞的增殖、降低其凋亡，進一步的遷移實驗發(fā)現(xiàn)外源性STC1蛋白可明顯增強膀胱癌細胞的遷移能力，而Bai 等[8]研究發(fā)現(xiàn)STC1通過細胞周期蛋白E1(cyclin E1)/周期蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinase 2 )通路促進前列腺癌細胞增殖，前期研究發(fā)現(xiàn)STC1在RCC患者癌組織中表達上調，STC1表達水平與RCC總體生存呈負相關[4]，如果術前就可以判斷患者預后將臨床意義更大，關于血清STC1判斷RCC預后方面的研究報道較少，本研究通過檢測RCC患者外周血清中STC1表達情況，研究外周血清中STC1表達水平與RCC患者臨床病理參數(shù)的關系，初步探討血清中STC1表達異常在判斷RCC患者預后方面的臨床意義。

眾所周知，腫瘤診斷學研究的一個熱點是尋找敏感度、特異度高的的腫瘤標志物不僅有助于術前診斷，也可用于腫瘤預后評估，目前尚無有效的腫瘤標記物來判斷腎細胞癌預后情況。STC1異常表達與RCC預后關系成為近幾年的研究熱點。曾金敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)RCC患者外周血STC1基因表達陽性，進而通過RCC在細胞水平研究發(fā)現(xiàn)不同濃度STC1影響腎癌細胞的增殖與凋亡。Ma等[6]研究發(fā)現(xiàn)在細胞水平STC1通過調節(jié)HIF-1α來調控RCC腫瘤細胞的增殖，并且發(fā)現(xiàn)RCC患者腫瘤組織在STC1基因和蛋白水平表達均顯著上調，進一步抑制STC1可以抑制腎癌細胞生長遷徙和浸潤侵襲，STC1可能通過促進上皮間皮變使RCC發(fā)生遠處轉移[10]。本研究采用Real-time PCR和ELISA法檢測2組血清中STC1表達情況。結果顯示，試驗組患者血清中STC1在基因和蛋白水平表達均明顯高于對照組(P<0.05) ，與既往文獻報道STC1在各種腫瘤中表達水平上調，如肝細胞癌[11]、胃癌[12]、卵巢癌[13-14]和乳腺癌[15]和結腸癌[16]相一致。本課題組之前研究也發(fā)現(xiàn)RCC腫瘤組織STC1 中表達上調，提示RCC患者血清SCT1水平與癌組織中SCT1均表達升高[4]。

本研究通過檢測STC1在RCC患者和正常人群血清中的表達情況，探討 STC1與RCC患者臨床病理特征的關系以及其在判斷RCC患者預后中的價值。發(fā)現(xiàn)RCC患者外周血STC1基因高表達多見于已經出現(xiàn)臨床癥狀、Fuhrman分級為Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤伴有壞死、AJCC腎癌臨床分期多為Ⅲ期和Ⅳ期和出現(xiàn)淋巴結轉移及遠處轉移的患者。關于STC1與RCC臨床病理變量的關系，Ma等[6]也研究發(fā)現(xiàn)RCC腫瘤組織中STC1的基因表達水平和RCC患者組織的Fuhrman分級和臨床分期明顯相關。前期研究也發(fā)現(xiàn)的RCC腫瘤組織中高STC1 的表達水平與RCC不良預后密切相關[4]。此外，既往也有較多文獻報道了STC1在其他腫瘤中的預后作用，如Chan等[11]發(fā)現(xiàn)血清中STC1高表達與肝細胞癌更大的腫瘤直徑和更差的5年無病生存相關；Brantley等[15]發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤組織中STC1的表達水平與乳腺癌晚期復發(fā)有著較強的關聯(lián)，STC1的表達水平越高，乳腺癌晚期復發(fā)概率越高。由于臨床分期、淋巴結轉移和是否遠處轉移在很大程度上決定了RCC患者的預后。本研究通過分析外周血STC1表達水平與RCC患者預后的相關性，發(fā)現(xiàn)STC1表達水平與伴發(fā)臨床癥狀、高Fuhrman分級和AJCC腎癌臨床分期、出現(xiàn)淋巴結轉移及遠處轉移等預后不良因素明顯相關。本研究生存分析也證實了RCC血清中STC1的高表達者預后不良。由于血清STC1的高表達不具備組織特異性，需要結合患者病史及影像學檢查綜合評估。本研究為單中心回顧性研究，并且樣本量較少，故需多中心大樣本前瞻性臨床研究進一步證實。

總之， 外周血清STC1高表達對RCC患者可能有較高的臨床應用價值，有望成為RCC患者判斷預后的新的腫瘤標志物。