吳熙 陳寧 秦美蓉 王曉煒 王平

【中圖分類號】R89

【文獻標志碼】B

【文章編號】1005-0019（2020）19-218-02

歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods， ECVAM）的創(chuàng)立是以保護動物在試驗和其他科學研究方面的使用為目的，發(fā)展審批有助于縮減、優(yōu)化、替代（Reduce，Refine，Replace，3Rs）動物試驗的替代方法[1]。EpiSkinTM測試方法作為一種全新的皮膚刺激性試驗在2007年通過歐盟替代方法驗證中心的驗證（EURL ECVAM）并被OECD指導原則收錄。EpiSkinTM是對人天然皮膚的模擬，即將分離的人表皮細胞接種在特定的生物材料上進行培養(yǎng)， 以形成具有三維結(jié)構(gòu)的人表皮樣皮膚模型，并具備以下特征：（1）組織學上具備人表皮樣結(jié)構(gòu)， 即有基底層、棘細胞層、顆粒細胞層和角質(zhì)層， 且角質(zhì)層具有基本的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。（2）功能上角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的屏障作用能夠在一定程度上抵擋有害物質(zhì)對下層活性細胞的毒性作用。

本實驗采用EpiSkinTM 3D人工皮膚模型，按照歐盟OECD 439推薦使用的4種用于皮膚模型刺激性測試的化學品，同時遵循OECD 439的實驗流程進行皮膚模型的化妝品刺激性測試，并根據(jù)其判斷標準來預測化學品對于皮膚的刺激性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 EpiSkinTM 皮膚模型（上海斯安膚諾生物科技有限公司） EpiSkinTM 皮膚模型以正常人的角質(zhì)形成細胞為種子細胞，在體外發(fā)育成復層化結(jié)構(gòu)的表皮模型。在組織學結(jié)構(gòu)上與人皮膚結(jié)構(gòu)高度相似，含有角質(zhì)層、顆粒層、棘層和基底層，見圖1。

1.1.2 試劑 噻唑藍（MTT）（Sigma，美國）、異丙醇（上海凌峰化學試劑有限公司）、含鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（DPBS）（Gibco，美國）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（Gibco，美國）、維持培養(yǎng)基（上海斯安膚諾生物科技有限公司）、測試培養(yǎng)基（上海斯安膚諾生物科技有限公司）。

1.1.3 受試物 硬脂酸甲酯、1-甲基-3-苯基哌嗪、庚醛、兔耳草醛，十二烷基磺酸鈉（SDS）均購自Sigma公司，均為化學純試劑。

1.1.4 儀器設(shè)備 細胞培養(yǎng)箱、通風柜、振蕩器、酶標儀、電子天平、超純水機、專用打孔器、四通道計時器。

1.2 方法

1.2.1 實驗依據(jù)及原理 該實驗方法依據(jù)國際經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）化學品測試指南439[2]的規(guī)定進行。基本原理是刺激性化學物質(zhì)作用于皮膚模型引起的刺激作用類似于細胞毒性損傷作用，通過3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（簡稱MTT） 法檢測細胞活性來判斷化學物的皮膚刺激性。

1.2.2 質(zhì)量控制 EpiSkinTM3D人工皮膚模型（中國生產(chǎn)）是來源于中國人角質(zhì)形成細胞的重建人類表皮模型，通過檢測確保不攜帶HIV、乙肝和丙肝病毒、細菌和支原體。

基于質(zhì)量控制的指標，EpiSkinTM3D人工皮膚模型可用于正式皮膚刺激性測試。對于每一種化學品，需要3輪不同批次的皮膚模型來對其進行皮膚刺激性的測試。

1.2.3 實驗前準備

（1）在無菌培養(yǎng)板中加入維持培養(yǎng)基，用鑷子將組織移至新的培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放置在37℃通有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

（2）在培養(yǎng)板孔中加入0.3mg/mL的MTT溶液，將待測樣品（10μL或10mg）分別加入孔中，將載有MTT溶液和待測樣品的培養(yǎng)板放在37℃通有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。如果MTT溶液顏色變成藍色或紫色，說明待測樣品與MTT反應(yīng)，在之后的刺激性測試中需使用死皮對照以去掉非特異性光密度值。

1.2.4 分組 實驗設(shè)陰性對照和陽性對照。PBS為陰性對照組，5%SDS為陽性對照組，硬脂酸甲酯、1-甲基-3-苯基哌嗪、庚醛、兔耳草醛為受試物組。

1.2.5 加樣量 液體樣品每孔10μL。固體樣品每孔（10±2）mg，并加入5μL蒸餾水，使其溶解。

1.2.6 實驗步驟

（1）化學品10 μL（固體10 mg研成粉末，同時加蒸餾水5 μL）局部接觸面積約0.37 cm2的皮膚模型表面15 min;（2）陰性對照加10 μL PBS、陽性對照加10 μL 5%SDS;（3）與化學品接觸15 min后用25 mL PBS沖洗活性皮膚，浸入2.0 mL維持培養(yǎng)基內(nèi)。1-3步需在通風安全柜中進行;（4）繼續(xù)在飽和濕度、5% CO2、37 ℃的條件下孵育42 h;（5）浸入2.0 mL濃度0.3 mg/mL的MTT溶液（用測試培養(yǎng)基配制）內(nèi)，在飽和濕度、5% CO2、37 ℃孵育3 h;（6）MTT反應(yīng)完的皮膚模型，浸入500 μL酸化異丙醇的離心管內(nèi)，混勻，在室溫、避光的條件下過夜;（7）振蕩混合儀混勻每個離心管，每管中取200 μL標本加入96孔板中，在570 nm處用酶標儀讀取光密度值，以酸化異丙醇溶液作為空白對照。按照下列公式，將所得光密度值換算為組織細胞存活率，用組織細胞存活率來判斷化學品是否具有刺激性，陰性對照的平均光密度值相當于100%的細胞存活率。

細胞存活率（%）=（受試物光密度值/陰性對照組光密度值）×100%

1.2.7 結(jié)果判定

根據(jù)受試物三輪試驗測試的細胞存活率計算平均值得到該受試物的組織細胞存活率，按表1判定標準進行刺激等級判定。

1.2.8 系統(tǒng)成立的條件 須同時滿足以下三個條件：

（1）陰性對照平均光密度值介于0.6-1.5之間，SD（%）≤18;

（2）陽性對照平均細胞存活率≤40%，SD（%）≤18;

（3）受試物的細胞存活率是通過三輪獨立的實驗（即3個不同批次）獲得的平均值，每輪實驗每個受試物設(shè)3個皮膚模型單位進行評價，同批次模型受試物的評價等級需一致。

2 結(jié)果

4 種化學品的細胞存活率見表1。

根據(jù)本研究實驗結(jié)果，對所測試的4種化學品與歐洲替代方法驗證中心（ECVAM）的化學品分類標準測試結(jié)果進行比較（這4種化學品分類標準是依據(jù)兔皮膚實驗體內(nèi)測試），同時也與歐盟認可皮膚模型EpiSkin在歐洲的體外測試結(jié)果比較，結(jié)果見表2。

在4種化學品中，ECVAM體內(nèi)測試分類數(shù)據(jù)表明刺激性化學品為3種，本實驗皮膚模型能正確分類3種;非刺激性化學品為1種，本實驗能正確分類1種，準確率達到100%。

3 討論

本實驗選擇的4種化合物各自具有典型的特點，物理狀態(tài)包括液態(tài)和固態(tài)。液態(tài)化合物中庚醛為易揮發(fā)物質(zhì)，而EpiSkinTM人工皮膚模型加樣量僅為10 μL，并且需涂抹20 s，環(huán)境溫度和凈化操作臺的風向可能對實驗結(jié)果影響較大，所以其數(shù)值結(jié)果較大。兔耳草醛可以與MTT相互作用影響實驗結(jié)果，因此需使用死皮對照以去掉非特異性光密度值。本實驗選擇3種刺激性化合物和1種非刺激性化合物，實驗結(jié)果與ECVAM體內(nèi)測試分類數(shù)據(jù)一致，EpiSkinTM人工皮膚模型可以評估化學品的皮膚刺激性。

動物實驗在研究疾病、開發(fā)檢測醫(yī)藥和疫苗、評價化學物質(zhì)的危險性等諸多方面，有著不可或缺的重要作用。隨著各國有關(guān)動物福利法律的完善，尋找替代動物實驗的科學方法得到了各國政府和科學工作者的關(guān)注。許多發(fā)達國家廣泛開展了體外替代方法的研究和驗證工作，已涉及到皮膚刺激和腐蝕性實驗、眼刺激和腐蝕性實驗、光毒性實驗、皮膚致敏性實驗以及熱原檢驗等[4-6]。EpiSkinTM人工皮膚模型已經(jīng)過多個國家的實驗室驗證，并被收錄在OECD指導原則中，是國際上認可的模型。

參考文獻

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[3] Carine Tornier， Martin Rosdy， Howard I. Maibach. In vitro skin irritation testing on reconstituted human epidermis： Reproducibility for 50 chemicals tested with two protocols [J]. Toxicology in Vitro 20 （2006） 401–416.

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