程娟 何環(huán) 衡曦彤 趙陽 劉健 石開儀 曹清河 李成果

摘要：篩選到1株對云南省昭通褐煤降解效果較好的菌株H3，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，該菌株與青霉菌Penicillium griseopurpureum的相似度為96%。通過正交試驗(yàn)篩選H3菌株生物降解昭通褐煤產(chǎn)游離腐殖酸的主要影響因素，結(jié)果表明，煤樣粒度會明顯影響H3菌株對煤的生物降解，并且當(dāng)粒度小于0.074 mm、反應(yīng)溫度為30 ℃、反應(yīng)時間為7 d時，菌株H3對褐煤的降解效果最好，經(jīng)降解后褐煤中游離腐殖酸含量為70.34%，提高35.87%，降解率達(dá)到56.25%。通過工業(yè)分析、X射線衍射儀（XRD）、傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）分析了微生物降解前后褐煤性質(zhì)的變化，結(jié)果表明經(jīng)H3菌株降解后昭通褐煤的水分和固定碳含量略有上升，而揮發(fā)分和灰分含量略有下降，煤中一部分芳香環(huán)可能被真菌破壞，使其微晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同時，經(jīng)過微生物降解后的褐煤，部分碳碳雙鍵和碳氮單鍵消失，說明原煤部分官能團(tuán)被破壞。

關(guān)鍵詞：褐煤;生物降解;游離腐殖酸;青霉菌;降解工藝優(yōu)化

中圖分類號： TQ536;S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0296-06

我國煤炭資源較豐富，其中低階煤含量占煤炭總儲備量的50%，低階煤包含褐煤、長焰煤、弱黏煤、不黏煤、氣煤、焦煤等[1]。目前，直接燃燒利用低階煤存在嚴(yán)重的能效和環(huán)境問題，因此實(shí)現(xiàn)低階煤的清潔高效利用意義重大。低階煤是一種富含腐殖酸的資源，其中腐殖酸的含量為10%～80%，從中提取的腐殖酸具有較高的生化活性，屬于高附加值產(chǎn)品，目前已在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、炭材料制備等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[2-3]。提取低階煤腐殖酸所用的傳統(tǒng)化學(xué)方法污染大、成本高。

生物技術(shù)方法是一種環(huán)境友好型辦法，近年來利用微生物降解煤獲取腐殖酸的方法應(yīng)用也越來越廣泛[3]。Can等利用RBK 7細(xì)菌菌株對哈薩克斯坦褐煤進(jìn)行降解，從中提取了腐殖酸并應(yīng)用于香菜種植，發(fā)現(xiàn)提取的腐殖酸對土壤肥力和發(fā)芽率有改善作用[4]。Yang等采用Penicillium decumbens P6純化酯酶降解褐煤，結(jié)果表明酯酶對褐煤有解聚作用，可產(chǎn)生腐殖酸[5]。Miszkiewicz等利用尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）1101菌株降解氧化劑預(yù)處理的褐煤，結(jié)果顯示尖孢鐮刀菌1101菌株能夠提高褐煤的液化程度和游離腐殖酸含量[6]。

煤種、菌種的選擇及匹配情況是影響微生物降解煤效果的重要因素;除此之外，在煤和菌種確定的情況下，微生物降解煤的主要影響因素有煤粒度、菌接種量、溶煤時間、溶煤溫度、環(huán)境溫度等[7-8]。Kang等采用4種細(xì)菌對神木褐煤進(jìn)行了生物降解試驗(yàn)，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，得到最佳條件下煤的生物降解率可達(dá)53.6%[9]。Sabar等從巴基斯坦低階煤樣品中分離得到1株真菌（AD-1菌株），對AD-1菌株介導(dǎo)的煤降解反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，表明AD-1菌株在1.5%葡萄糖和0.5%加煤率的條件下培養(yǎng)11 d可以釋放出煤樣中大量的有機(jī)物[10]。尹艷通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了多黏類芽孢桿菌降解褐煤的工藝條件，得到煤樣粒度、菌液用量、降解時間、煤漿濃度等各因素的最優(yōu)水平[11]。

腐殖酸按照存在形態(tài)可分為游離腐殖酸和（鈣、鎂）結(jié)合腐殖酸[12]。結(jié)合態(tài)腐殖酸生物活性較低，在農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中無法直接應(yīng)用，只有游離腐殖酸才具有固氮、解磷、釋鉀的良好作用[13]，因此提高煤質(zhì)腐殖酸中水溶性游離腐殖酸含量有著重要意義。云南省昭通市褐煤儲存量很豐富，其中所含的煤質(zhì)腐殖酸資源有待利用。本研究從云南省昭通市褐煤煤田周邊土壤中分離菌種，篩選出對褐煤有較好液化效果的真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，然后通過正交試驗(yàn)優(yōu)化影響生物降解試驗(yàn)的因素，并對褐煤降解前后進(jìn)行物化性質(zhì)分析，以期為該地區(qū)褐煤資源的利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 真菌的篩選鑒定

本試驗(yàn)采用的褐煤樣品來源于云南省昭通市的露天褐煤，其中總腐殖酸、游離腐殖酸含量分別為37.55%、34.47%。從取回昭通褐煤樣品中分離真菌，將分離得到的真菌利用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基[14]培養(yǎng)，菌種長滿平板后，在菌體表面均勻地撒上0.3 g褐煤樣品，將平板倒置，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次微生物對煤的降解情況。采用真菌DNA抽提試劑盒（HP Fungal DNA Kit，產(chǎn)品編號為D3195，OMEGA公司）提取真菌DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃變性 10 min;94 ℃變性30 s，57 ℃ 復(fù)性30 s，72 ℃延伸 60 s，30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]切膠純化的PCR產(chǎn)物送至廣州賽哲生物科技股份有限公司測序。將菌株的基因序列與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)中GenBank序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，選取與之同源性最高的5種菌株的基因序列，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，比較其序列同源性。

1.2 褐煤生物降解條件優(yōu)化

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步篩選昭通褐煤降解的最優(yōu)條件。選用培養(yǎng)48 h的菌種進(jìn)行平板溶煤試驗(yàn)，設(shè)置煤樣粒度（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時間（C）等3個影響因素，每個因素分別設(shè)置3個水平，不考慮各因素的交互作用[15-16]。如表1、表2所示，正交試驗(yàn)采用L9（34）正交表。測定反應(yīng)前后褐煤的降解率、游離腐殖酸含量，根據(jù)GB/T 35107—2017《礦物源腐殖酸肥料中可溶性腐殖酸含量的測定》[17]測定褐煤中游離腐殖酸的含量，降解率（η）的計(jì)算方法如下：

使用直徑為15 cm的大平板，將菌種劃線培養(yǎng)72 h后，菌絲布滿整個平板，撒入0.8 g不同粒徑的干燥褐煤煤樣，分別放在28、30、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求反應(yīng)3、5、7 d。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水沖洗掉平板上殘留的煤樣，沖洗液于10 000 r/min條件下離心10 min，隨后收集沉淀物，于70 ℃恒溫箱中干燥至恒質(zhì)量，分析褐煤的降解率和游離腐殖酸含量。

1.3 褐煤生物降解前后理化性質(zhì)的分析

用去離子水將平板上生物降解后的殘煤沖洗下來，在10 000 r/min條件下離心10 min，將離心管中的沉淀物于100 ℃干燥3 h后收集樣品。將原煤和殘煤樣品研磨至粒度為75 μm，制備好煤樣送至江蘇地質(zhì)礦產(chǎn)設(shè)計(jì)研究院進(jìn)行工業(yè)分析。煤樣研磨至粒度為 48 μm，于105 ℃真空干燥2 h，采用德國布魯克公司D8 Advance型X射線衍射（XRD）儀分析原煤和降解后殘煤礦物組成;將樣品與溴化鉀粉按質(zhì)量比1 ∶ 120的比例混合，研磨成片劑樣品，采用德國布魯克公司VERTEX 80 V型傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對原煤和殘煤樣品進(jìn)行分析，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32次[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的篩選鑒定

從昭通褐煤中分離出H3菌株，將倒置平板于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后加煤培養(yǎng)，觀察結(jié)果如圖1所示。H3菌株菌落呈乳白色，菌絲不斷擴(kuò)大直到覆蓋整個培養(yǎng)皿，生長后期變成暗綠色。待菌落長滿培養(yǎng)皿，均勻撒入0.3 g褐煤煤樣（煤樣過200目篩，于70 ℃烘箱中干燥3 h預(yù)處理），72 h后觀察褐煤降解情況，可以看到菌株生長狀況良好，其中H3菌株平板上出現(xiàn)了明顯的液滴（如圖1-b中箭頭所示），說明該菌株對昭通褐煤具有降解效果。

對H3菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，利用PCR擴(kuò)增ITS區(qū)域，測序后與GenBank中的已知序列進(jìn)行對比，結(jié)果如圖2所示，H3菌株與Penicillium griseopurpureum的部分序列相似率為96%，期望值為0，與原物種序列相似度為99%，由此可以確定H3菌株為青霉屬真菌。

2.2 正交試驗(yàn)

由表3、表4分析可知，試驗(yàn)結(jié)果的影響因素表現(xiàn)為A>C>B，即煤樣粒度對該試驗(yàn)影響最大，其次為反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度影響最小。在試驗(yàn)條件下A、B、C 3個因素的最優(yōu)水平組合為A3B2C3，即煤樣粒度小于0.074 mm、反應(yīng)溫度為 30 ℃、反應(yīng)天數(shù)為7 d，在該條件下經(jīng)降解后褐煤中游離腐殖酸含量為70.34%，相較原煤（據(jù)“1.2”節(jié)測得原煤中游離腐殖酸的含量為34.47%）提高35.87%，降解率達(dá)到56.25%。

煤樣粒度為0.150～0.500 mm、0.074～0.150 mm 時，反應(yīng)產(chǎn)生的游離腐殖酸含量基本相同，在煤樣粒度小于0.074 mm時，游離腐殖酸含量大幅增加;煤樣粒度越小，煤樣與菌絲體接觸的面積就越大，更容易與煤反應(yīng)，加速降解作用，產(chǎn)生腐殖酸[19]。由觀察結(jié)果可知，游離腐殖酸含量隨著溫度上升而下降，筆者推測28 ℃可能是H3菌株的最佳生長溫度，因此在28 ℃時降解效果最佳，隨著溫度升高降解效果減弱。降解時間達(dá)到7 d，游離腐殖酸含量相比之前最高，表明隨著降解時間增長，游離腐殖酸含量不斷提高，提高幅度逐漸減少，可能隨著時間的延長培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不足，從而無法滿足菌體降解煤的需要[20]。

2.3 生物降解前后煤的物化性質(zhì)

對褐煤原煤以及最佳試驗(yàn)條件處理后的殘煤進(jìn)行工業(yè)分析，如表5所示，反應(yīng)后褐煤的灰分和揮發(fā)分含量都有所降低，固定碳含量增加，說明微生物會降解煤產(chǎn)生一部分腐殖酸碳，從而使固定碳含量增加。

如圖3所示，反應(yīng)前后峰的位置沒有變化，說明其礦物組成無明顯變化，但是反應(yīng)后的峰強(qiáng)度變化較大，據(jù)Jiang等的研究[21]可初步判定褐煤經(jīng)過降解后，結(jié)晶度變高。從表6可以看出，反應(yīng)前后褐煤的片層間距從0.171 8 nm增加至0.172 3 nm，增加的數(shù)值很小，基本不變;反應(yīng)前后的層片堆砌厚度（Lc）從原來的 1.087 6 nm 上升至1.116 9 nm，層片原來的2.129 nm轉(zhuǎn)變?yōu)?.186 nm，La隨煤化程度的增加而增大。綜上所述，褐煤降解前后煤的微晶結(jié)構(gòu)的變化可能是微生物降解過程中降解平均堆砌厚度增高，Lc為1.2 nm時，芳香層片的堆砌層數(shù)為3～4層，反應(yīng)前后的層片直徑（La）由了一部分芳香環(huán)，使其微晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[22-23]。

如圖4、表7所示，結(jié)合Choudhury等的研究[24-25]對比反應(yīng)前后褐煤的FT-IR分析結(jié)果可知，褐煤降解前后出峰的位置基本未發(fā)生變化。其中，原煤中碳碳雙鍵吸收峰消失，可能是在微生物轉(zhuǎn)化過程中雙鍵斷裂，結(jié)合氧生成了C—O等含氧官能團(tuán);原煤仲酰胺的C—N吸收峰消失，也說明降解后的褐煤部分官能團(tuán)被破壞[26-28]，證明H3菌株對褐煤有一定的降解作用。

3 結(jié)論

本研究分離鑒定了1株對云南昭通褐煤有降解效果的菌株H3，采用正交試驗(yàn)對H3菌株降解褐煤的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化并對降解前后煤的物化性質(zhì)進(jìn)行了分析，得到結(jié)論如下：

（1）菌株H3在固體平板上菌落呈乳白色，生長后期菌絲變綠，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明該菌株與Penicillium griseopurpureum序列相似率為96%，因此將其命名為Penicillium griseopurpureum H3，固體平板溶煤試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株對褐煤具有較好的降解效果。

（2）正交試驗(yàn)結(jié)果表明菌株降解褐煤產(chǎn)生游離腐殖酸的最佳條件為煤樣粒度小于0.074 mm、反應(yīng)溫度為30 ℃、反應(yīng)時間為7 d，在該條件下褐煤中游離腐殖酸含量為70.34%，提高35.87%，降解率達(dá)到56.25%。

（3）經(jīng)菌株H3降解后褐煤的灰分和揮發(fā)分含量都降低，固定碳含量增加，在降解過程中產(chǎn)生了一部分芳香環(huán)，使得其微晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同時，經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化后的褐煤，碳碳雙鍵和碳氮單鍵消失，證明原煤部分官能團(tuán)被破壞。

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