王龍 周慶平 劉建明

摘要：通過對(duì)采自甘肅甘南藏區(qū)的16株野生羊肚菌菌株進(jìn)行分子生物學(xué)分析，對(duì)rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，鑒定得知，16株供試羊肚菌共歸納為5種，分別為黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）、羊肚菌（Morchella esculenta）、高羊肚菌（Morchella elata）、粗腿羊肚菌（Morchella crapssipes）和尖頂羊肚菌（Morchella conica）。根據(jù)采用最大簡(jiǎn)約法（MP）和鄰接法（NJ）構(gòu)建的分子進(jìn)化樹得知，2種分子進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，并且Bootstrap驗(yàn)證顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支都有很高的支持率，說明其系統(tǒng)關(guān)系有很高的可信度。結(jié)果可為該地區(qū)羊肚菌（Morchella spp.）的系統(tǒng)分類提供較為準(zhǔn)確的分子性狀依據(jù)。

關(guān)鍵詞：rDNA-ITS;羊肚菌;序列分析;甘肅甘南

中圖分類號(hào)： S646.701 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0081-04

羊肚菌（Morchella spp.）是羊肚菌科羊肚菌屬所有種類的總稱，是一類經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的珍稀野生食（藥）用真菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。據(jù)有關(guān)資料顯示，羊肚菌含有多種生理活性物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)含量極為豐富，同時(shí)還含有人體必需的各類氨基酸、維生素和鐵、鋅等多種礦質(zhì)元素[2-3]。在羊肚菌的分類學(xué)研究中，由于其形態(tài)特征具有很大的可塑性和人為性，給分類研究工作帶來(lái)很多困難，單純依靠傳統(tǒng)形態(tài)分類方法很難解決羊肚菌的系統(tǒng)學(xué)問題，分子生物學(xué)的飛速發(fā)展為從分子水平解決羊肚菌的系統(tǒng)學(xué)問題提供了新的技術(shù)方法和研究平臺(tái)[4-6]。針對(duì)我國(guó)羊肚菌主產(chǎn)地之一的甘肅甘南藏區(qū)，到目前為止，除20世紀(jì)80年代有學(xué)者開展過有關(guān)當(dāng)?shù)匮蚨蔷Y源學(xué)方面的研究報(bào)道外[7-8]，至今鮮見有關(guān)該地區(qū)羊肚菌分子系統(tǒng)學(xué)方面的研究。鑒于上述問題，本研究試圖從傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)以及分子系統(tǒng)學(xué)角度來(lái)探討甘肅甘南境內(nèi)野生羊肚菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為2017年4—5月在甘肅甘南境內(nèi)的迭部縣、舟曲縣收集到的野生羊肚菌菌株。供試菌株總共16株，結(jié)合《中國(guó)大型真菌原色圖鑒》[9]對(duì)菌株進(jìn)行鑒定并分別編號(hào)為GN-M1、GN-M2、GN-M3、GN-M4、GN-M6、GN-M9、GN-M10、GN-M12、GN-M14、GN-M17、GN-M19、GN-M22、GN-M25、GN-M27、GN-M31、GN-M32（圖1）。

1.2 主要試劑

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）裂解緩沖液（pH值為8.0，美國(guó)Genview公司）;2×PCRmix（上海時(shí)代生物科技有限公司）;DL2000 DNA marker（日本Takara公司）;瓊脂糖（上海艾研生物科技有限公司）;EDTA（乙二胺四乙酸）、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、鹽酸、乙酸鈉、氯化鈉、Tris（三羥甲基氨基甲烷）均為國(guó)產(chǎn)分析純。擴(kuò)增ITS片段（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體為上游引物ITSl：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.3 總DNA提取

取供試菌株羊肚菌子實(shí)體的菌蓋部分，參照白永宏等的研究方法[10]，經(jīng)多次改進(jìn)、驗(yàn)證，探索出適合本試驗(yàn)的DNA提取技術(shù)。（1）稱取浸泡、沖洗、消毒后的羊肚菌子實(shí)體菌蓋約0.5 g，切碎置于無(wú)菌預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，研磨至粉末狀。（2）迅速將其轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入1.5 mL預(yù)熱至65 ℃的CTAB（pH值為8.0）裂解緩沖液，緩慢顛倒混勻后，置于65 ℃下水浴1.5 h，每隔10 min顛倒混勻1次。（3）在 12 000 r/min 下離心15 min，將上清液移至新的離心管中。（4）加入等體積的苯酚和氯仿，緩慢搖勻，在 12 000 r/min 下離心10 min，將上清液移至新的離心管中。（5）加入等體積的氯仿和異戊醇，緩慢搖勻，在12 000 r/min下離心 10 min，將上清液移至新的離心管中。（6）加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕混勻，在-20 ℃下靜置3.0 h后在12 000 r/min 下離心 10 min，棄去上清液，留DNA沉淀。（7）用75%乙醇洗滌DNA沉淀2次，棄去上清液。（8）離心、真空抽干得到DNA，每管加入適量無(wú)菌水溶解沉淀DNA，在-20 ℃下低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

1.4.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，含10×PCR buffer 5.0 μL;dNTPs 1.0 μL;模板DNA 1.0 μL;ITS1 1.0 μL;ITS4 1.0 μL;Taq聚合酶1.0 μL;雙蒸水40.0 μL。

1.4.2 PCR擴(kuò)增程序 PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，終止溫度為 4 ℃。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳譜帶。

1.5 ITS片段測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，使用上?；瞪锛夹g(shù)有限公司提供的UNIQ-10柱式DNA回收試劑盒進(jìn)行回收和純化，并將樣品報(bào)送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的菌株序列結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST分析，利用軟件CLUSTALX 1.81刪除缺失位點(diǎn)和殘缺位點(diǎn)，然后進(jìn)行同源性比較，最后用軟件MEGA 6.06通過最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）和鄰位相連法（neighbour joining，NJ）分別構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，明確供試菌株的種屬及分類地位[11-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

16株野生羊肚菌ITS片段PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

2.2 ITS序列測(cè)序及BLAST比對(duì)分析

本試驗(yàn)中的16株羊肚菌標(biāo)本所測(cè)得的ITS序列長(zhǎng)度和GC含量見表1。登陸Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，將所測(cè)得的序列進(jìn)行BLASTN比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GN-M1、GN-M2、GN-M6和GN-M10的核苷酸序列與登錄號(hào)為JQ691485、DQ257338、AJ698476、JX069625的黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）ITS序列相似度達(dá)99%;GN-M3、GN-M4、GN-M9和GN-M12與登錄號(hào)：U51851、AJ543741的羊肚菌（Morchella esculenta）ITS序列相似度達(dá)99%;GN-M14、GN-M22、GN-M17和GN-M19與登錄號(hào)為GQ249378、GQ249383、EU83482的高羊肚菌（Morchella elata）ITS序列相似度達(dá)97%～98%;GN-M25和GN-M31與登錄號(hào)為EU701002的粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）ITS序列相似度達(dá)99%;GN-M27和GN-M32與登錄號(hào)：AM269501的尖頂羊肚菌（Morchella conica）ITS序列相似性達(dá)97%～98%。

2.3 基于ITS序列系統(tǒng)樹的構(gòu)建

為了更好地探討甘肅甘南藏區(qū)野生羊肚菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載了與本研究相關(guān)的羊肚菌科鐘菌屬（Verpa）的3個(gè)ITS序列（登錄號(hào)分別為GU551670、GU551672、JN043311）以及羊肚菌屬中的普通羊肚菌（Morchella vulgaris）、小海綿羊肚菌（Morchella spongiola）、半開羊肚菌（Morchella semilibera）、變紅羊肚菌（Morchella rufobrunnea）（登錄號(hào)分別為AF000971、JQ691480、AF008233、DQ355921）的ITS序列，對(duì)其進(jìn)行BLASTN比對(duì)分析后，分別采用鄰接法（neighbour-joining，NJ）和最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）構(gòu)建分子進(jìn)化樹，結(jié)果分別見圖3和圖4。

由圖3和圖4可以看出，NJ和MP這2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，并且Bootstrap驗(yàn)證顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支都有很高的支持率，說明系統(tǒng)關(guān)系的可信度高。結(jié)合測(cè)序結(jié)果分析，本試驗(yàn)中16株羊肚菌經(jīng)分子鑒定最終歸類為5種，分別為黑脈羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）、羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9、GN-M12）、高羊肚菌（GN-M14、GN-M22、GN-M17、GN-M19）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）和尖頂羊肚菌（GN-M27、GN-M32），這5種羊肚菌主要?dú)w類于黃羊肚菌類群（羊肚菌、粗腿羊肚菌）和黑羊肚菌類群（尖頂羊肚菌、黑脈羊肚菌、高羊肚菌）。

通過對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹的分析發(fā)現(xiàn)，登錄號(hào)為GU551670和GU551672的鐘菌屬（Verpa）的2個(gè)菌種聚為一支，但登陸號(hào)為JN043311的鐘菌屬（Verpa）的1個(gè)菌種卻和羊肚菌聚為一類;登錄號(hào)為AF000971的普通羊肚菌和登陸號(hào)為JQ691480的小海綿羊肚菌與羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9和GN-M12）、黑脈羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）親緣關(guān)系較近，可以聚為一類;登錄號(hào)為DQ355921的變紅羊肚菌與尖頂羊肚菌（GN-M27、GN-M32）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）大體聚為一類;登錄號(hào)為AF008233的半開羊肚菌與其他羊肚菌遺傳距離較遠(yuǎn)，似乎可與鐘菌屬（Verpa）的2個(gè)菌種GU551670和GU551672聚為一類，究其原因還有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

經(jīng)分子生物學(xué)研究得知，16株供試羊肚菌菌株可歸納為5種，分別為黑脈羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）、羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9、GN-M12）、高羊肚菌（GN-M14、GN-M22、GN-M17、GN-M19）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）和尖頂羊肚菌（GN-M27、GN-M32），且這5種羊肚菌主要?dú)w類于黃羊肚菌類群（羊肚菌、粗腿羊肚菌）和黑羊肚菌類群（尖頂羊肚菌、黑脈羊肚菌、高羊肚菌）。通過分子進(jìn)化樹分析得知，利用最大簡(jiǎn)約法（MP）和鄰接法（NJ）2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，并且Bootstrap驗(yàn)證顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支都有很高的支持率，說明其系統(tǒng)關(guān)系有很高的可信度，同時(shí)也說明本研究結(jié)果可為該地區(qū)羊肚菌的系統(tǒng)分類提供較為明確的分子性狀依據(jù)。本研究中的羊肚菌經(jīng)分子鑒定后的結(jié)果與依據(jù)形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果有一定差異，分析原因可能是該地區(qū)羊肚菌子實(shí)體的形態(tài)變化多樣，其菌種的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)又受多種外界因素的影響，這對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類具有很大的限制性。至于當(dāng)前甘肅甘南境內(nèi)還分布有該屬多少種羊肚菌，還有待今后全方位地采集更多新鮮樣品進(jìn)行分離鑒定。此項(xiàng)工作的開展不但可以豐富該地區(qū)羊肚菌多樣性分析的菌種資源庫(kù)資料，還可為當(dāng)?shù)匮蚨蔷娜斯ぴ耘嗉捌浣窈蟮拈_發(fā)利用提供科學(xué)理論與依據(jù)。

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