胡利娟 賈元 田忠靜 馮群 劉杰 朱斌

摘要：遺傳多樣性分析可為野生植物的開發(fā)與保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。采集貴州地區(qū)的29份石斛資源，通過簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeats，簡稱ISSR）標(biāo)記對其進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從16條引物中篩選出13條多態(tài)性穩(wěn)定的ISSR引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，13條引物共擴(kuò)增出214個條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為212個，多態(tài)性比例為99.07%，平均每個引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為16.46條。隨后利用非加權(quán)平均距離法（UPGMA）對其進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，29份石斛材料的遺傳相似系數(shù)為0.678～0.804。在遺傳相似系數(shù)為0.715處，可以把29種石斛植物劃分為10個類群，從而證明所取石斛材料的遺傳多樣性十分豐富。

關(guān)鍵詞：石斛;ISSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;親緣關(guān)系

中圖分類號： S567.23+9.01 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0076-05

石斛屬（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）的大屬之一，屬附生蘭類多年生草本植物。全球約有 1 500 多種石斛屬植物，主要分布于亞洲、歐洲、大洋洲等地[1]，中國現(xiàn)共有76種石斛屬植物，主要產(chǎn)區(qū)分布于四川、云南、廣西和貴州等省份的原始森林以及安徽、浙江等省份[2]。大多數(shù)石斛具有藥用和觀賞價值，目前發(fā)現(xiàn)的藥用石斛有39種，具有潤肺生津、活血化瘀、治療心血管疾病等功效[3]。由于石斛種類繁多，歷代本草著作稱之為醫(yī)工難辨的種類[4]。隨著人們對藥用及觀賞石斛需求量的不斷擴(kuò)大和森林砍伐等多方面的影響，野生石斛屬植物資源面臨枯竭，已經(jīng)成為瀕危植物[5]。近年來，由于人們對藥用石斛需求量的加大，石斛種植面積不斷增加，選育優(yōu)良石斛品種供生產(chǎn)使用尤為重要。

為了更好地利用藥用石斛種質(zhì)資源，更準(zhǔn)確地了解石斛種質(zhì)資源的類型及親緣關(guān)系，對石斛資源進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析顯得尤為重要[6]。目前應(yīng)用于石斛屬植物種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系研究的分子生物學(xué)方法主要有隨機擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）、簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeats，簡稱ISSR）等[7-9]。ISSR技術(shù)是由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkewicz等發(fā)展起來的一種基于微衛(wèi)星（SSR）序列的分子標(biāo)記技術(shù)，與SSR相比，用于ISSR的引物不需要預(yù)先的DNA測序，而是用半隨機引物進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得豐富的多態(tài)性[10]。ISSR標(biāo)記的特點是數(shù)量豐富、廣泛分布于整個基因組、具有較多的等位性變異與共顯性標(biāo)記、可鑒別出雜合子和純合子、試驗的重復(fù)性較好等。本研究選用29種石斛材料，采用ISSR-PCR分子標(biāo)記研究其遺傳多樣性，并創(chuàng)建親緣關(guān)系圖譜進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

本研究共選用29種石斛材料（表1），其中27種為石斛屬，1種為石豆蘭屬，1種為釵子股屬，目前統(tǒng)一種植于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院四樓實驗室。

試驗試劑：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯酚、三氯甲烷、異戊醇、鹽酸、無水乙醇等，均購自貴州凱信生物科技有限公司;2×Taq Master Mix（Dye），含有0.1 U/μL Taq DNA聚合酶、3 mol/L氯化鎂和40 μmol/L dNTPs，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;ISSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

試驗儀器：ETC811PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）;DYY-8C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;DYCP-31E型電泳槽（北京六一生物科技有限公司）;K8360凝膠成像分析系統(tǒng)（北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司）;離心機（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 基因組DNA的提取

從實驗室栽培的石斛植株上取幼嫩葉片，參考CTAB法[11]并加以調(diào)整，用于提取植物基因組DNA。調(diào)整后的方法如下：剪取0.1 kg石斛的幼嫩葉片（新鮮葉片也可）放置于研缽中，加入750 μL 2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）CTAB水溶液進(jìn)行研磨，將葉片充分研磨后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，65 ℃水浴60 min（其間每 20 min 搖勻 1 次），取出離心管冷卻到室溫，在通風(fēng)櫥內(nèi)通風(fēng)狀態(tài)下加入750 μL苯酚+三氯甲烷+異戊醇（體積比為25 ∶ 24 ∶ 1）的混合液，上下顛倒搖勻，置于離心機中12 000 r/min離心 15 min，輕輕取出，取上清液500 μL于新的試管中，向上清液中加入1 000 μL冰的無水乙醇沉淀DNA（無水乙醇在提取DNA前先置于-20 ℃冰箱中凍存一段時間），在-20 ℃條件下放置20 min或更長時間（放置時間的長短可根據(jù)DNA的析出程度調(diào)節(jié)，若DNA析出較多，則不用在-20 ℃條件下長時間放置）。DNA析出后，置于離心機中8 000 r/min離心5 min去除上清液，沉淀用50%乙醇清洗3次，第3次清洗時乙醇不倒出，放置過夜，第2天離心后倒掉上清液乙醇，放置于室溫下晾干或置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干，至DNA沉淀呈透明狀，再加入200 μL無菌去離子水溶解DNA，溶解后置于-20 ℃保存。

1.3 引物的篩選

ISSR引物是根據(jù)楊立昌等公布的引物序列[11-12]合成的，從生工生物工程（上海）股份有限公司合成的16個引物中篩選出13個擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物用于29份石斛材料種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。

1.4 ISSR-PCR擴(kuò)增

ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。參考ISSR反應(yīng)體系[13]并加以改進(jìn)，改進(jìn)后的22 μL反應(yīng)體系如下：4 μL DNA，1 μL引物，8 μL Mix（含有氯化鎂、dNTP、Taq酶、反應(yīng)緩沖液），9 μL超純水。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性7 min;94 ℃變性 1 min，退火45 s[退火溫度依據(jù)不同引物而定（表2）]，72 ℃延伸2 min，共45個循環(huán);72 ℃復(fù)性 7 min，4 ℃保存PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 電泳

用1×TAE緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠，將凝膠放置于含有1×TAE緩沖液的電泳槽中，使緩沖液沒過凝膠表面約2 mm。PCR產(chǎn)物上樣量為 18 μL，使用Super DNA marker標(biāo)定擴(kuò)散片段長度，在90 V電壓下電泳90 min，再置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察，檢測ISSR-PCR電泳譜帶。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

按照電泳圖譜中同一位置上DNA條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，構(gòu)成0/1矩形圖，用NTSYS 2.10軟件SHAN程序中的非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）對樣品進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建29種石斛材料的親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的選擇

本研究用16個引物對29種石斛材料的基因組DNA進(jìn)行預(yù)試驗擴(kuò)增，并對16個引物進(jìn)行篩選，獲得13個多態(tài)性較好的引物，然后用篩選出的13個引物對29種石斛材料進(jìn)行擴(kuò)增。從表3看出，擴(kuò)增條帶數(shù)最多的是引物ISSR-1，擴(kuò)增出21個條帶，擴(kuò)增條帶最少的是引物T3B，只擴(kuò)增出11個條帶。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)對凝膠成像系統(tǒng)拍照結(jié)果的分析得到0/1矩陣圖（本文未列出）。由圖1和圖2可以看出，電泳共檢測出214個擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為212個，多態(tài)性比例為99.07%，平均每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為16.46條，說明供試樣品具有較高的多態(tài)性。

2.3 遺傳相似性及親緣關(guān)系

由圖3可以看出，13條引物能將29種石斛材料分開，遺傳相似系數(shù)（GS）變化范圍為0.678～0.804，表明供試樣品有較近的親緣關(guān)系。在遺傳相似系數(shù)0.715處，可以將石斛材料分為10個大組，每個大組又分為不同的小組：第1組，包含7種石斛，分別是鐵皮石斛、報春石斛、銅皮石斛、串珠石斛、黃貝殼石斛、釵子股、石豆蘭，說明該大組內(nèi)7種石斛的親緣關(guān)系比較近，其中鐵皮石斛與報春石斛的遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.790，在29種石斛植物中，這2種石斛的遺傳相似系數(shù)排第3;第2組，包含4種石斛，分別是尖刀唇石斛、鼓槌石斛與大龜背石斛、黑毛石斛，其中鼓槌石斛、大龜背石斛的遺傳相似系數(shù)為0.800，是29種石斛材料中親緣關(guān)系最近的2種;第3組，包含3種石斛，分別是扭瓣石斛、蜂腰石斛、赤水金釵石斛，其中扭瓣石斛與蜂腰石斛的遺傳相似系數(shù)為0.795，在29種石斛材料中，是除了鼓槌石斛與大龜背石斛之外遺傳相似系數(shù)最高、親緣關(guān)系最近的2種石斛;第4組，包含3種石斛，分別是腫節(jié)石斛、杯鞘石斛、翅梗石斛;第5組，包含2種石斛，分別是密花石斛、喉紅石斛;第6組，包含4種石斛，分別是反瓣石斛、球花石斛、杓唇石斛、燈籠石斛，其中反瓣石斛與球花石斛的遺傳相似系數(shù)為0.790，親緣關(guān)系也非常近;第7組，包含3種石斛，分別是蜻蜓石斛、劍葉石斛、線葉石斛;第8組，包含虎牙石斛;第9組，包含紅牙刷石斛;第10組，包含天宮石斛。從聚類分析結(jié)果可以看出，虎牙石斛、紅牙刷石斛、天宮石斛這3種石斛與其他26種石斛的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

石斛屬植物分布在中國秦嶺淮河以南諸省，其中云南、廣西、臺灣、貴州為分布中心[14]。根據(jù)傳統(tǒng)的分類方法，石斛屬植物可以分成不同的組別，《中國植物志》將中國石斛的74個種劃分為12個組[15]，其中藥用石斛有39種，并且有的石斛種類僅從莖、葉等形態(tài)上無法加以區(qū)分[16]。因此，分子標(biāo)記也被應(yīng)用于石斛的分子鑒定中。DNA分子標(biāo)記不受環(huán)境因素的影響，能直接反映基因組DNA之間存在的差異[17]?，F(xiàn)代分子標(biāo)記不僅可用于石斛植物的分子鑒定，還能全面揭示不同石斛種群的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。本研究選用29種石斛為樣本，采用13條引物分析不同石斛品種資源的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，微衛(wèi)星位點多態(tài)性比例達(dá)到99.07%，表明石斛的遺傳多樣性極其豐富。在所選擇的13條引物中，有的引物擴(kuò)增條帶數(shù)較多，如引物ISSR-1的擴(kuò)增條帶數(shù)為21條，引物UBC899的擴(kuò)增條帶數(shù)為20條。但也有部分引物的擴(kuò)增條帶數(shù)較少，如引物T3B、CTC4Rca、UBC811分別只擴(kuò)增出了11、12、13條條帶，可見不同石斛有著復(fù)雜的遺傳背景。

本研究中石斛的ISSR分子標(biāo)記聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類結(jié)果基本相同，但也存在差異，可能與分析過程中取樣的多少、基因組DNA的提取方法、PCR擴(kuò)增體系的異同等有關(guān)。自然環(huán)境因子的復(fù)雜多樣性也可能是造成這種差異的原因。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)方法被應(yīng)用于石斛屬植物種質(zhì)資源的鑒定和親緣關(guān)系的研究中，如RAPD、RFLP、AFLP等。在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步采用多種分子生物學(xué)方法對同一石斛屬植物材料的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析。

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