王會林 劉德全 楊 虹

EffectofBDNFonApoptosisofHippocampalNeuronsinNon-cardiacIschemicStrokeRatsandItsMechanism.WangHuilin,LiuDequan,YangHong.DepartmentofNeurology,LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Henan471000，China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of brain derived neurotrophic factor (BDNF) on apoptosis of hippocampal neurons in noncardiac ischemic stroke rats and its mechanism.MethodsForty five rats, 10 were reserved for the sham operation group, 35 were for the establishment of a non-cardiac ischemic stroke model, thirty one were successfully modeled and randomly divided into 10 rats in the model group, 10 rats in the no-load group, and 11 rats in the BDNF group. The no-load group and BDNF group were injected with pGenesiI-1-NC and pGenesiI-1-BDNF liposome plasmid complexes into the subarachnoid space respectively, and normal saline was injected into the model group and sham operation group. After 5 days, the learning and memory abilities of rats, pathological morphological changes of hippocampus and apoptosis of hippocampal neurons was observed, and BDNF, tyrosine receptor kinase B (TrkB) and phosphatidyl inositol-3-kinase (PI3K), serine-threonine protein kinase (AKT) mRNA and protein expression, p-AKT/AKT expression changes were detected.ResultsHE staining showed that the neurons in the model group and the no-load group were disordered and degenerated neurons appeared. The neurons in the BDNF group were slightly injured. Compared with the sham operation group, the escape latency, quadrant stay time were shorted, the numbers of crossing platforms were decreased of the water maze experiments, the hippocampal neuron apoptosis rates were increased, the relative expressions of BDNF, TrkB, PI3K mRNA and protein, and p-AKT/AKT were reduced in the model group, the no-load group, and the BDNF group(P<0.05). Compared with the model group and the no-load group, the escape latency, quadrant stay time were prolonged, the numbers of crossing platforms were increased of the water maze experiments, the apoptosis rates of hippocampal neurons were decreased, the relative expression levels of BDNF, TrkB, PI3K mRNA and protein, and p-AKT/AKT in hippocampus were increased(P<0.05).ConclusionUp-regulating the expression of BDNF can reduce the apoptosis of hippocampal neurons and protect neurons in non-cardiac ischemic stroke rats. The mechanism may be by activating the PI3K/AKT signaling pathway to play a protective role.

KeywordsBrain derived neurotrophic factor; Stroke; Hippocampal neuron; Apoptosis

非心源性缺血性腦卒中是臨床常見多發(fā)的腦血管疾病，發(fā)生率、致殘率、復發(fā)率和致死率均較高[1]。各種原因引起腦血管損害，導致局部血液供應障礙，引發(fā)腦組織功能障礙，對應神經功能缺失，進而發(fā)展成為腦卒中[2，3]。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)對神經系統(tǒng)具有營養(yǎng)作用，可以保護神經元免受損傷，對神經元的生存、生長和發(fā)育至關重要[4，5]。研究表明，腦卒中患者血清中BDNF含量顯著降低，與認知障礙有關，應用BDNF基因治療缺血性腦卒中具有潛在應用價值[6]。本研究通過基因轉染將外源BDNF注入缺血腦組織，觀察BDNF對腦卒中大鼠的影響，并探討其調控機制，以期為臨床治療缺血性腦卒中提供新思路和新方法。

材料與方法

1.實驗動物：SD雄性大鼠45只，SPF級，6～7周齡，平均體質量230±20g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011，溫度24±1℃，光照12h/黑暗12h，購入后適應性飼養(yǎng)1周。

2.藥物、試劑和儀器：真核表達質粒pGenesiI-1-NC、pGenesiI-1-BDNF(武漢市晶賽技術有限公司)，LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)，兔抗大鼠BDNF多抗、酪氨酸受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)多抗、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K)多抗、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine-thre-onine protein kinase，AKT)多抗、p-AKT多抗、山羊抗兔IgG-HRP(英國Abacm公司)，ZS-001moriss水迷宮(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)。

3.建立模型：依據(jù)文獻[7]，采用改良Longa線栓法制備缺血性腦卒中大鼠模型。各組大鼠稱重后用水合氯醛(10%)按3ml/kg體質量腹腔注射進行麻醉。麻醉成功后，取35只大鼠，剪開左側頸部皮膚，鈍性分離肌群，暴露并游離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸總動脈近心端和頸外動脈，夾閉頸內動脈遠端，在距頸總動脈1cm處切開一小口，將魚線自頸總動脈插入頸內動脈，至出現(xiàn)阻力，深度18 ～20mm，線栓即到達并阻塞左側大腦中動脈開口處，扎緊動脈殘端縫合傷口，消毒傷口以防感染。待大鼠清醒后放入籠中單獨飼養(yǎng)，參照文獻[8]對大鼠神經功能進行評分：0=活動正常，無神經功能缺損癥狀；1=對側前爪不能完全伸展；2=爬行時向偏癱側旋轉；3=行走時向對側傾倒；4=意識喪失，不能自發(fā)行走；5=死亡。得分3～4分的大鼠視為建模成功，建模成功大鼠31只隨機分為模型組10只，空載組10只，BDNF組11只。其余10只大鼠為假手術組，阻塞線插入頸內動脈深度約5mm，剩余步驟同上。

4.干預方法：建模成功1h后，將pGenesiI-1-NC/pGenesiI-1-BDNF與LipofectamineTM2000充分混勻，制成脂質體質粒復合物，室溫靜置20min；BDNF組和空載組分別將含有pGenesiI-1-BDNF和pGenesiI-1-NC的脂質體質粒復合物緩慢注入大鼠蛛網膜下腔，同時腹腔注射30000U青霉素以防感染，假手術組和模型組注入0.9%氯化鈉溶液。

5.水迷宮實驗：干預5天后，進行水迷宮實驗觀察大鼠學習和記憶能力。水迷宮水池直徑120cm，高60cm，水深25cm，水溫23±1℃，將水迷宮分為4個象限，在第3象限正中放置直徑10cm，高23cm的圓形平臺。定位航行實驗：將大鼠面向池壁依次放入各個象限入水點，記錄大鼠在60s內找到平臺的時間(逃避潛伏期)，超過60s未找到記為60s，每天訓練2次，間隔15min，共訓練5天，第6天記錄各組大鼠逃避潛伏期?？臻g探索試驗：第7天撤出平臺，任選一相同入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄其60s目標象限的停留時間以及跨越平臺次數(shù)。

6.HE染色以及TUNEL染色：水迷宮實驗結束后，處死大鼠，斷頭取腦，剝離左側海馬組織于10%中性甲醛中固定24h后，脫水、浸蠟、包埋、切片，常規(guī)HE染色，封片后置于顯微鏡下觀察海馬組織病理變化情況并拍照。取海馬組織切片，按照TUNEL試劑盒說明書進行染色，置于顯微鏡下觀察，計算凋亡細胞百分率，凋亡率(%)=凋亡神經元數(shù)/神經元總數(shù)×100%。

7.BDNF、TrkB、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平的檢測：取海馬組織70mg，加入裂解液，冰上勻漿，低溫離心后取上清，100℃水浴5min，進行蛋白變性，冷卻后BCA法蛋白定量，實施SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，加入BDNF、TrkB、PI3K、AKT及β-actin一抗，搖床4℃封閉過夜，加HRP-IgG二抗，室溫封閉2h，加入ECL發(fā)光液，暗室曝光、顯影，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

結 果

1.學習記憶能力：與假手術組比較，模型組、空載組、BDNF組逃避潛伏期、目標象限停留時間均縮短，穿越平臺次數(shù)均減少(P<0.05)；與模型組、空載組比較，BDNF組逃避潛伏期、目標象限停留時間延長，穿越平臺次數(shù)增多(P<0.05)；模型組與空載組上述指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 大鼠學習記憶能力

2.海馬區(qū)病理學變化：HE染色顯示，假手術組神經元形態(tài)規(guī)則、排列緊密、染色質均勻；模型組神經元排列紊亂，出現(xiàn)大量變性神經元，胞體縮小、胞核固縮、胞質嗜酸性增強深伊紅染色，成為紅色神經元；空載組神經元排列紊亂，有大量紅色神經元，與模型組病理形態(tài)相似；BDNF組神經元排列散亂，紅色神經元減少，較模型組、空載組神經元損傷輕微(圖1)。

圖1 海馬CA1區(qū)病理學變化(HE，×400)A.假手術組；B.模型組；C.空載組；D.BDNF組

3.海馬神經元凋亡率：假手術組、模型組、空載組、BDNF組海馬神經元凋亡率分別為1.03%±0.12%、22.71%±2.38%、21.34%±2.27%、10.59%±1.23%。與假手術組比較，模型組、空載組、BDNF組海馬神經元凋亡率均升高(t=28.769、28.254、24.415，P=0.000)；與模型組、空載組比較，BDNF組海馬神經元凋亡率降低(t=14.871、13.675，P=0.000)；模型組、空載組海馬神經元凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.317，P=0.204，圖2)。

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)神經元凋亡情況(TUNEL，×400)A.假手術組；B.模型組；C.空載組；D.BDNF組

4.海馬組織中BDNF、TrkB、PI3K、AKT蛋白表達：與假手術組比較，模型組、空載組、BDNF組BDNF、TrkB、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT均降低(P<0.05)；與模型組、空載組比較，BDNF組BDNF、TrkB、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT均升高(P<0.05)；模型組與空載組BDNF、TrkB、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3)。

圖3 BDNF、TrkB、PI3K、AKT蛋白水平的變化A. 蛋白印跡；B. BDNF、TrkB、PI3K、AKT蛋白表達水平；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與空載組比較，△P<0.05

討 論

隨著神經科學技術的發(fā)展，腦血管病的研究獲得了巨大進步，但缺血性腦卒中致殘率和病死率依然很高，目前尚無普遍實用的治療方法[9]。發(fā)生缺血性腦卒中時，腦局部血管受損引起神經功能障礙，伴有神經元凋亡與功能缺失，對缺血組織針對性治療可有效減少腦卒中危害。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些神經營養(yǎng)因子在腦組織發(fā)生缺血時可以有效減少神經細胞凋亡，保護缺血后神經組織損傷[10，11]。因此，通過外源神經營養(yǎng)因子對腦部缺血組織進行治療，有利于神經組織修復和再生，為缺血性腦卒中患者后期康復改善提供可能性方法。

缺血性腦卒中發(fā)生時伴有感覺、運動和認知障礙，表現(xiàn)為偏癱以及神經系統(tǒng)定位癥狀和體征,還可以導致言語、記憶等認知功能障礙,嚴重者甚至發(fā)生癡呆,對患者預后有重要影響。BDNF與神經元的生存、生長及分化過程關系密切，是神經系統(tǒng)發(fā)育過程中的關鍵信號分子，對神經系統(tǒng)的發(fā)育至關重要。研究表明，在合并性癲癇和抑郁模型大鼠海馬中BDNF表達顯著降低，引發(fā)神經功能障礙[12]。Zhang等[13]及Wu等[14]研究證實，增加BDNF表達可促進大腦神經元生成，提高神經學、運動活動和腦病理評分，降低病死率。Ravina等[15]研究表明，向大腦遞送BDNF可以減少神經炎癥，恢復神經功能缺陷。本研究成功建立缺血性腦卒中大鼠模型，過表達BDNF后，大鼠逃避潛伏期、目標象限停留時間顯著延長，穿越平臺次數(shù)顯著增多，HE鏡檢神經元損傷較模型組輕微，同時神經元細胞凋亡率顯著降低，提示BDNF可以減少腦卒中神經元細胞凋亡，促進神經元細胞修復和再生，具有保護神經元細胞、減少神經損傷的作用。

BDNF可以作為信號轉導通路的配體，特異性與受體TrkB結合，促進神經元細胞發(fā)育、分化和再生，對神經元存活發(fā)揮重要作用[16，17]。BDNF結合TrkB后可以激活多條下游信號轉導通路，其中PI3K/AKT通路對抗細胞凋亡有積極作用，對神經元生長起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路在多種缺血性損傷中起著重要作用，可保護神經細胞功能，減少缺血損傷[18，19]。Yang等[20]研究表明，通過激活PI3K/AKT信號通路可減少紋狀體神經元細胞凋亡，保護神經細胞。Jiang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路激活可增強大鼠學習和記憶能力。本研究過表達BDNF后，BDNF、TrkB、p-AKT蛋白水平顯著升高，提示過表達BDNF通過結合TrkB，激活下游PI3K/AKT通路，保護神經元細胞，改善認知能力。

綜上所述，過表達BDNF可減少缺血性腦卒中海馬神經元細胞凋亡，保護神經元細胞，其機制可能是通過激活PI3K/AKT通路發(fā)揮保護作用，為臨床治療腦卒中提供新思路。